Cơ chế hoạt động của hệ thống CRISPR-Cas9

Series bài viết

• Cơ chế hoạt động của CRISPR/CAS9 
• Ứng dụng linh hoạt CRIPSR/Cas9 trong chỉnh sửa bộ gen  
• Phương thức sử dụng CRISPR/Cas9 tạo đột biến indel knockout gen mục tiêu

CRISPR/Cas9 đang thu hút sự quan tâm của hầu hết các nhà khoa học trên toàn thế giới trong lĩnh vực chỉnh sửa bộ gen và các lĩnh vực sinh học khác cũng được hưởng lợi từ kỹ thuật này. Được khám phá từ một cơ chế tự vệ trong vi khuẩn, hệ thống này có thể dễ dàng lập trình để cắt và chỉnh sửa bất kỳ trình tự DNA nào ở các loài khác nhau. Vậy, cơ chế của nó như thế nào? Ứng dụng vào những gì? Quy trình thực hiện ra sao? Liệu ngoài những ưu điểm, CRISPR/Cas9 có nhược điểm nào không?

Bước quan trọng đầu tiên trong việc chỉnh sửa bộ gen của một sinh vật là lựa chọn trình tự gen mục tiêu. Trong hệ thống CRISPR/Cas9 bao gồm hai đại phân tử chính bao gồm một protein Cas9- một protein có hoạt tính như một enzyme cắt tại vị trí chuyên biệt (endonuclease) và một RNA dẫn đường (guide RNA), tương tác nhau để tạo thành một phức hợp có thể xác định trình tự mục tiêu với độ chọn lọc cao.

Các protein Cas9 chịu trách nhiệm cho việc định vị và cắt DNA mục tiêu, cả trong tự nhiên và trong các hệ thống CRISPR/Cas9 nhân tạo. Một protein Cas9 có cấu tạo gồm 6 tiểu phần: REC I, REC II, cầu nối Helix, PAM Interacting, HNH và RuvC (Hình 1) (Jinek et al. 2014; Nishimasu et al. 2014)

REC I là tiểu phần lớn nhất và có trách nhiệm định hướng cho gRNA. Vai trò của REC II vẫn chưa được hiểu rõ. Các cầu xoắn giàu arginine là rất quan trọng để bắt đầu hoạt động bám vào và cắt DNA mục tiêu (Nishimasu et al. 2014). Tiểu phần PAM-Interacting tạo cho PAM đặc tính chuyên biệt và do đó chịu trách nhiệm xúc tác cho sự bám của Cas9 vào DNA mục tiêu (Anders et al 2014;.. Jinek et al 2014; Nishimasu et al 2014;. Sternberg et al 2014.). Các tiểu phần HNH và RuvC là các nuclease, có vai trò cắt DNA sợi đơn. HNH và RuvC là những tiểu phần có độ tương đồng cao vì vậy chúng còn được tìm thấy ở những phân tử protein khác (Jinek et al. 2014; Nishimasu et al. 2014).

Hình 1

Các protein Cas9 sẽ ở  trạng thái bất hoạt trong trường hợp có gRNA. Trong các hệ thống CRISPR/Cas9 nhân tạo, gRNA bao gồm một sợi đơn RNA tạo thành một hình chữ T (Hình 2). Các gRNA được thiết kế để có đầu 5’ là trình tự bổ sung với trình tự DNA mục tiêu

Hình 2

gRNA nhân tạo liên kết với các protein Cas9 và khi tương tác tạo thành phức hợp sẽ gây ra một sự thay đổi về hình dạng của protein (Hình 3). Sự thay đổi về hình dạng này sẽ kích hoạt Cas9 chuyển sang trạng thái hoạt động. Cơ chế của sự thay đổi về hình dạng không được hiểu hoàn toàn nhưng Jinek và các đồng nghiệp đưa ra giả thuyết rằng sự tương tác về không gian hay liên kết yếu giữa các tiểu phần protein và gRNA có thể là nguyên nhân gây ra sự thay đổi (Jinek et al. 2014).

Hình 3

Khi các protein Cas9 được kích hoạt, nó sẽ tìm kiếm DNA mục tiêu bằng cách liên kết với các trình tự phù hợp với trình tự PAM (protospacer adjacent motif) của nó (Sternberg et al. 2014). Một PAM là một trình tự 2-3bp được gắn liền kề sau trình tự bổ sung của gRNA. Các trình tự PAM đã được xác định trong tất cả các hệ thống CRISPR, và các nucleotide cụ thể xác định PAM được chuyên biệt cho các loại hệ thống CRISPR (Mojica et al. 2009). PAM trong Streptococcus pyogenes là 5′-NGG-3 ‘(Jinek et al. 2012). Khi protein Cas9 tìm thấy một trình tự mục tiêu phù hợp với trình tự PAM, Cas9 sẽ tách các base phía trước trình tự PAM và bắt cặp với vùng bổ sung trong đoạn gRNA (Sternberg et al. 2014). Nếu vùng bổ sung và vùng mục tiêu bắt cặp đúng thì RuvC và HNH nuclease sẽ cắt DNA mục tiêu tại vị trí nuclotide thứ  4 phía trước PAM (Anders et al. 2014) tạo ra vùng DSB (double strand break) (Hình 4).

Hình 4

 Hình 5 [2]: Kết quả sửa đổi gen sử dụng hệ thống enzyme nuclease.

a | Nuclease-Cas9 cắt DNA mục tiêu tạo ra DSB có thể dẫn đến chèn một trình tự, điều chỉnh hoặc thay đổi nucleotide (vùng màu đỏ) thông qua HDR với sự hiện diện của một DNA lạ hoặc một single-strand oligodeoxynucleotide (ssODN), cả hai đều tương đồng với trình tự mục tiêu. DSBs cũng có thể được sửa chữa thông qua một đoạn không tương đồng với trình tự mục tiêu (NHEJ- non-homologous end-joining), và do đó thường dẫn đến một đoạn chèn nhỏ hoặc xóa (insertion/delection-indels). Trình tự indel điển hình và các số chèn (3 và 1) hoặc xóa (-2, -4 và -10) nucleotide được hiển thị.

b | Khi hai DSBs được tạo ra trong cis trên một nhiễm sắc thể đơn bởi hệ thống enzyme nucleases, vùng ở giữa 2 vị trí cắt (flanking region) có thể bị loại bỏ hoặc ngược lại. c | Khi hai DSBs được tạo ra trên hai nhiễm sắc thể khác nhau, sự bắt cặp chéo (translocations) nhiễm sắc thể có thể được tạo ra

Nguồn: ibsgacademic.com