MỘT SỐ CÁCH KHẮC PHỤC LỖI KỸ THUẬT PCR

Đối với bất kỳ thí nghiệm nào, các vấn đề đều có thể xảy ra. Để giải quyết những vấn đề này, chúng ta cần phải phát triển một quy trình để phát hiện các nguồn có thể gây ra lỗi. Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để khuếch đại các đoạn DNA cụ thể. Với giao thức đơn giản rõ ràng và chi phí thấp, PCR là một phương pháp được áp dụng rộng rãi. Điều đang được nói ở đây là các lỗi có thể và sẽ xảy ra, và biết các bước đi đúng để giải quyết vấn đề là cần thiết. Khi phát triển một giao thức xử lý sự cố PCR, điều quan trọng là phải nhận thức được bất kỳ lỗi nào có thể xảy ra và khám phá từng vấn đề tiềm ẩn một cách độc lập. Quan trọng nhất là xử lý sự cố cũng giống như  kỹ năng; nó được cải thiện với việc thực hành và kinh nghiệm. Dưới đây là một số cách khắc phục lỗi PCR thường gặp nhất:

Lấy hỗn hợp Master mix phù hợp (chuẩn)

Các vấn đề sảy ra đối với việc pha trộn hỗn hợp master mix (là hỗn hợp chứa tất cả các thành phần phản ứng trừ khuôn DNA) có thể gây ra sự thất bại khuếch đại trong tất cả các mẫu và đối chứng dương. Dưới đây là một vài mẹo để tìm ra hỗn hợp master mix phù hợp cho thử nghiệm của bạn:

Trước khi lặp lại thí nghiệm, cần kiểm tra tất cả các thành phần trong master mix cùng với nồng độ của chúng. Nếu một lô mới của thuốc thử (chất phản ứng) đã đang được sử dụng, đó là một cách phòng ngừa hữu ích để chạy mới so với cũ trước khi áp dụng vào một loạt lớn các thí nghiệm. Khi chuyển đổi các sản phẩm master mix, điều quan trọng là phải nhận thấy rằng một số xét nghiệm đặc biệt nhạy cảm với thành phần đệm, nhiệt độ ủ (Ta)  và nồng độ primer. Việc thay đổi bất kỳ một trong các yếu tố này có thể dẫn đến hiệu suất khác nhau. Do đó, tất cả các thử nghiệm phải được kiểm tra trong các hỗn hợp master mix đã chọn và trên tất cả các dụng cụ mong muốn trước khi thực hiện thay đổi cơ bản

Bên cạnh đó cũng cần phải xem lại các hướng dẫn được cung cấp với mỗi hỗn hợp master mix khi đã chỉ ra các điều kiện được tối ưu hóa cho một enzym nhất định, chu trình nhiệt nhất định và các thành phần đệm. Đây là một cách tốt để thực tập trong phòng thí nghiệm để đảm bảo đủ hỗn hợp master mix cho tất cả các mẫu được chạy cùng nhau

Bắt cặp với các oligo phù hợp

    

Oligonucleotide dự định bắt cặp với DNA khuôn và được khuyếch đại bằng PCR được gọi là primers. Để bắt đầu, các mồi có trình tự đảo ngược của DNA mục tiêu. Khi nhận mồi đông khô cần lưu ý là:

Xác minh trình tự   

         

Đảm bảo rằng tất cả DNA được tái huyền phù trước khi sử dụng

Xác nhận dung dịch đúng là nồng độ dự kiến

Các chu kỳ lặp lại sự đông lạnh của đông lạnh cũng có thể ảnh hưởng đến hoạt động của oligo và do đó tất cả các oligos ở nồng độ stock (thường là 100 μM) cần được chia và lưu trữ ở -20 ° C hoặc-80 ° C.

Trong giai đoạn khắc phục sự cố, điều quan trọng là phải xác minh rằng trình tự đúng đã được sắp xếp bằng cách quay trở lại chuỗi mục tiêu và xác nhận rằng các trình tự oligo thực sự có mặt. Đảm bảo rằng chất lượng oligo là chính xác bằng cách liên hệ với nhà cung cấp oligo. Đo nồng độ hoạt động của oligo và kiểm tra trực quan các phân tử huỳnh quang để xác nhận rằng chúng được dán nhãn. Kiểm tra primer của các xét nghiệm thăm dò trong SYBR® Green I qPCR mix để xác minh khuếch đại. Xem xét việc tối ưu hóa nồng độ primer hoặc Ta. Khi sử dụng đầu dò lần đầu tiên, hãy thu thập dữ liệu huỳnh quang cho càng nhiều bước sóng càng tốt để có thể phát hiện ra sự rò rỉ tín hiệu giữa các kênh và có thể phát hiện sai sót trong bắt tín hiệu

Tối ưu hóa thiết kế khảo nghiệm

Khi khắc phục sự cố kiểm tra, đảm bảo rằng thiết kế đã được kiểm chứng. Xác nhận rằng primer PCR / qPCR và vị trí khuếch đại là phù hợp với sao chép ngược. Đảm bảo rằng thông tin trình tự là đáng tin cậy và các biến thể ghép nối và SNP đã được xem xét. Nếu bài kiểm tra là không nhạy cảm và các khuếch đại lô thấy bất thường cần chắc chắn:

Kiểm tra thiết kế khảo nghiệm

Kiểm tra các lần đọc huỳnh quang nền trên dữ liệu thô / biểu đồ nhiều thành phần

Xác minh tối ưu hoá

Hãy nhớ rằng phương pháp tối ưu hóa và xác nhận hợp lý là bước đầu tiên thiết yếu, ngay cả khi các xét nghiệm đã được thiết kế sẵn và có được thương mại.

Kết luận

Ngoài các quy trình PCR cơ bản, cần phát triển và sử dụng một giao thức khắc phục sự cố khi có vấn đề phát sinh. Hơn nữa, để bảo vệ chống lại sự không chắc chắn do biến đổi phản ứng, điều quan trọng là bao gồm một loạt các kiểm soát cùng với tất cả các mẫu trong bất kỳ thí nghiệm nào. Việc lựa chọn các kiểm soát và bao gồm các mẫu nào phải luôn phụ thuộc vào bản chất của thí nghiệm.

Nguồn: Biocompare.com.