Ứng dụng và nguyên lý của kỹ thuật southern blot

Series bài viết

• PCR cơ bản 
• Realtime PCR
• Multiplex PCR
• Western Blot
• Southern Blot
• Southern Blot

Kỹ thuật Southern blot là phương pháp lai giữa DNA của tế bào với mẫu dò DNA. Southern Blot cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào.

Nguyên lý kỹ thuật southern blot

• Dựa trên nguyên tắc biến tính và hồi tính của phân tử DNA.
• Dựa vào nguyên tắc bổ sung giữa các cặp nucleotide: A-T, G-C (các đoạn polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung).
• Màng lai nitrocellulose hay nylon có khả năng tiếp nhận DNA.

Nguyên tắc lai southern blot

• Phản ứng lai cần nhiệt độ cao hoặc hoá chất gây biến tính DNA ( NaOH, Formandehyt).
• Đòi hỏi một đoạn DNA (RNA) đã biết trình tự để làm mồi “Probe”. Probe được đánh dấu.
• Các vật liệu, trang thiết bị máy móc chính xác: màng lai, máy Blotting, buồng lai, máy PCR.

Quy trình

Giai đoạn 1: Tách chiết và làm biến tính các DNA thành sợi đơn

• Tách chiết DNA cần nghiên cứu
• DNA được cắt bởi các enzyme giới hạn (RE) thành các đoạn kích thước khác nhau.
• Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose
• DNA mạch kép được xử lý với kiềm, biến tính thành DNA mạch đơn ngay trên gel.

Giai đoạn 2: Chuyển DNA từ gel agarose lên màng lai (nylon hoặc nitrocellulose)

• Chuyển DNA vừa biến tính lên màng lai
• Màng lai sau quá trình trên được xử lý nhiệt hoặc chiếu tia UV để cố định DNA trên màng.

Giai đoạn 3: Lai với mẫu dò và kiểm tra bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi.

• Lai các DNA cố định trên màng lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ, biotin hoặc mẫu dò phát quang sinh học. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung của các mẫu dò với DNA cố định.
• Sau quá trình lai, màng lai được rửa để loại các mẫu dò không bắt cặp cặp chuyên biệt với DNA trên màng.
• Cuối cùng, nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi (đối với đầu dò đánh dấu phóng xạ), phương pháp so màu (với đầu dò đánh dấu bằng biotin) hay dựa vào sự phát quang (với các đầu dò phát quang sinh học) để định vị DNA –probe.

Kỹ thuật southern blot

Ứng dụng của kỹ thuật southern blot

• Southern blot được sử dụng dể đánh giá bản copy của gen trong genome, xác định các intron, exon, các đoạn bị đột biến thêm hoặc mất đoạn…
• Khi sử dụng các DNA marker khác nhau làm mẫu dò, có thể phân biệt được các loài, các loài đồng hình.
• Southern blot – RFLP: giúp phát hiện sự đa dạng chiều dài các đoạn cắt bởi RE, qua đó, nhận biết sự sai biệt di truyền ở vị trí nhận biết của các RE dẫn đến sai biệt trong chiều dài của các đoạn DNA tạo ra từ RE đó. Đồng thời, RFLP còn sử dụng để xác định huyết thống, lập bản đồ giới hạn gen.
• Chẩn đoán bệnh thai nhi

Nguồn: kythuatysinh.net