Tách chiết Plasmid

Nguyên lý tách plasmid

Việc tách plasmid ra khỏi ADN hệ gen (genome) là rất khó khăn. Tuy nhiên người ta có thể dựa vào sự khác nhau về mặt lý hóa của 2 loại ADN, bao gồm: kích thước, hình dạng, cấu trúc chung. Plasmid là những phân tử ADN nhỏ, mạch vòng, thường ở dạng siêu xoắn,  có khả năng tái bản độc lập và có kích thước 0.05 – 10% kích thước của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Trên cơ sở đó, người ta tiến hành dùng các hóa chất có tác dụng phá vỡ các liên kết hidro giữa các nucleotide của cả ADN plasmid và ADN genome dẫn đến ADN bị biến tính. Sau đó, tiến hành hồi tính:  ADN hệ gen không thể hồi tính do kích thước lớn và dễ dàng loại bỏ bằng ly tâm. Trong khi đó, ADN plasmid ở dạng siêu xoắn (supercoiled configuration) có đặc điểm là dễ dàng phục hồi lại hình dạng ban đầu dưới điều kiện hồi tính.

Một số phương pháp tách plasmid ở vi khuẩn.

Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm

• Tế bào vi khuẩn được xử lý với dung dịch chứa SDS và NaOH. Trong đó’
• SDS: biến tính protein – phá vỡ màng tế bào.
• NaOH: làm biến tính ADN genome và ADN plasmid.
• Sau đó, hỗn hợp được trung hoà bằng potassium acetate (CH3COOK) à ADN plasmid sẽ được hồi tính nhanh chóng và hoà tan trong dung dịch, còn ADN genome và các protein khác bị kết tủa và giữ lại trong phức hợp SDS-kali à ly tâm lại tủ và thu ADN plasmid tinh sạch.

Phương pháp đun sôi

• Vi khuẩn có chứa ADN plasmid được phá vỡ bằng lysozyme, Triton-X100 và nhiệt độ à DNA genome vẫn bám vào màng tế bào vi khuẩn, còn DNA plasmid được giải phóng và hoà tan trong dung dịch.
• Thu nhận ADN plasmid bằng cách tủa với alcohol.

Phương pháp dựa bào Lithium

• Xử lý mẫu với hỗn hợp Triton X-100/LiCl à màng trong của tế bào vi khuẩn bị phân huỷ.
• Bổ sung phenol/chloroform à biến tính và kết tủa các protein nội bào. Đồng thời, tế bào sẽ co lại nhanh chóng và đẩy dung dịch nội bào (có chứa ADN plasmid) ra ngoài; ADN genome và protein sẽ bị giữ lại trong sinh khối tế bào.
• Ly tâm à thu ADN plasmid

Phương pháp truyền thống trong tách chiết plasmid

1. Cấy chuyển 1 khuẩn lạc vào 5 ml môi trường LB có bổ sung kháng sinh và nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 37o
2. Chuyển dịch nuôi cấy vào các ống effendorf 1.5 ml và ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi.
3. Hoà tan tế bào trong 200 ml dung dịch I (GTE solution) dẫn đến phá vỡ màng tế bào, voltex mạnh để tế bào trộn đều trong dung dịch. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
4. Bổ sung 200 ml dung dịch II (0.2N NaOH, 1% SDS) dẫn đến biến tính ADN NST, lắc nhanh vài lần, ủ hỗ hợp trong đá 5 phút.
5. Bổ sung 300 ml dung dịch III để lạnh, vortex nhẹ, ủ hỗ hợp trong đá 10 phút.
6. Ly tâm 14000 vòng/phút, 10 phút ở nhiệt độ phòng.
7. Hút phần dịch sang một ống effendorf mới, bổ sung 0.5 ml isopropanol hoặc ethanol 100% lạnh, vortex.
8. Ly tâm 15000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi.
9. Rửa tủa bằng cách thêm từ từ 0.5 ml ethanol 70%, chắt bỏ cẩn thận, không làm mất tủa.
10. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng trong 10 – 15 phút.
11. Nhẹ nhàng hoà tan tủa trong 100 đệm TE 1X. Bảo quản ở -20o

Một số kit tách chiết DNA plasmid

1. ISOLATE II Plasmid Mini Kit- Bioline Anh Quốc: Dùng để tách chiết DNA plasmid
2. Plasmid Extraction Kit – Invitrogen: dùng để tách chiết DNA từ vi khuẩn.
3. Plasmid Extraction Kit – Invitrogen: có thể tách chiết được 10µg DNA plasmid, độ tinh sạch cao, sử dụng LyseBlue cho sự phân tách tối ưu và thu tối đa sản lượng DNA
4. Kit QIAprep Spin Miniprep: có thể tách chiết lên đến 20µg DNA plasmid với độ tinh sạch cao, thời gian nhanh. Khả năng tách cao hơn khi sử dụng High-Yield Supplementary Protocol (lượng tách được là 30µg)
5. ChargeSwitch™ NoSpin Plasmid Micro Kit: Kích cỡ mẫu 0,5-1 ml nuôi cấy qua đêm; Năng suất tiêu biểu lên tới 5 μg, tránh được các chất gây ô nhiễm enzym cho kết quả tốt hơn và tối ưu hóa cho qua trình tự động hóa. Chất phản ứng NoSpin mới tạo ra sự kết tụ tế bào vi khuẩn và cho phép các tế bào được viên kết tụ mà không cần ly tâm.
6. ChargeSwitch™ Plasmid ER Mini Kit: sử dụng công nghệ hạt từ tính cho phép tinh sạch DNA plasmid nhanh chóng và hiệu quả từ 1-5 ml nuôi cấy vi khuẩn qua đêm mà không sử dụng muối hỗn hợp, dung môi hữu cơ hoặc ethanol và tách được 20 μg DNA plasmid với tổng thời gian khoảng 10 phút sau khi chuẩn bị mẫu.

Tối ưu hóa cho việc chiết xuất DNA có độ tinh khiết cao hơn
Cải thiện hiệu suất với giá đỡ từ đi kèm