Một số thành tựu trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gen

Chuột chuyển gen

Vào năm 1982, Palmiter và Brinster đã thành công trong việc tạo ra động vật chuyển gen đầu tiên trên thế giới, bằng cách chuyển gen của loài chuột này sang phôi loài chuột khác. Gen chuyển đã biểu hiện ở chuột chuyển gen và các thế hệ con cháu của chúng. Hai nhà khoa học này đã nhận được giải thưởng Charles Leopold Mayer, giải thưởng cao quí nhất của Viện Hàn lâm khoa học Pháp vào năm 1994.

Chuột chuyển gen horrmone sinh trưởng (bên phải) và chuột đối chứng (bên trái)

Palmiter và Brinster đã chuyển một gen ngoại lai vào trứng chuột thụ tinh. Sau đó cấy các trứng này vào chuột mẹ thay thế và đã chứng minh được rằng gen chuyển hoạt động  chức năng trong một số chuột con sinh ra. Nhân giống chuột thế hệ con, các nhà khoa học đã cho thấy gen chuyển có thể được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác theo qui luật di truyền Mendel. Với kỹ thuật chuyển gen, Palmiter và Brinster tin tưởng rằng công việc này sẽ làm sáng tỏ vấn đề thông tin trong bản “thiết kế“ di truyền của chúng ta không được mã hoá trong các cơ thể sống như thế nào và các gen hoạt động trong quá trình phát triển bình thường cũng như trong trạng thái bệnh tật ra làm sao. Việc tạo ra chuột chuyển gen là một định hướng quan trọng trong nghiên cứu liệu pháp gen để điều trị các rối loạn gây nên bởi các lỗi của mã di truyền.

Palmiter và Brinster đã hiểu được cơ chế tế bào đọc mã di truyền và dịch các thông tin đó thành các cấu trúc sinh học. Kỹ thuật chuyển gen mà họ sử dụng dựa trên cơ sở là gen có hai phần chính: vùng mã hóa prtein và vùng điều hòa hoạt động của gen. Một gen ngoại lai có nguồn gốc từ cơ thể khác được nối với một vùng kiểm tra đóng-mở (on-off) và chịu tác động của vùng này. Palmiter và Brinster đã tiến hành sử dụng công tắc mở  là promoter MT (metallothionein). Promoter MT hoạt hóa bởi các ion kim loại đồng, kẽm và catmi, được nối với gen mã hoá enzyme thymidine kinase. Tổ hợp gen này được đưa vào trứng chuột vừa mới thụ tinh. Các nhà khoa học đã thấy rằng, bình thường ion catmi có tác dụng mở (turn on) gen MT, nhưng bây giờ nó mở gen thymidine kinase khi ở trong phôi chuột. Bằng cách tương tự, promoter MT được nối với gen hormone sinh trưởng chuột cống và sau đó chuyển vào chuột nhắt. Kết quả là các chuột nhắt “siêu hạng“ có kích thước lớn hơn chuột bình thường nhiều lần đã ra đời.

Chuột chuyển gen đã cung cấp cho Palmiter và Brinster phương pháp để kiểm tra các mô hình thí nghiệm và điều trị bệnh.

Cho đến nay hàng trăm gen khác nhau đã được đưa vào các dòng chuột khác nhau và kết quả là hàng trăm dòng chuột chuyển gen đã được tạo ra và được phân tích. Các nghiên cứu này đã góp phần cung cấp các hiểu biết về sự điều hòa hoạt động của gen, sự phát triển khối u, tính đặc hiệu của miễn dịch, di truyền học phân tử của sự phát triển và các quá trình sinh học cơ bản khác. Các mô hình chuột chuyển gen điều trị các bệnh như ung thư, bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, tiểu đường... cũng đã được nghiên cứu. Chuột chuyển gen còn được sử dụng để sản xuất các protein quí hiếm thông qua tuyến sữa và nước tiểu.

DNA có thể được đưa vào chuột nhờ vector retrovirus bằng cách  nhiễm vào các tế bào ở giai đoạn phôi sớm trước khi cấy vào con cái nhận; vi tiêm vào tiền nhân đực của trứng đã thụ tinh và đưa các tế bào gốc phôi đã thao tác di truyền vào phôi đang phát triển ở giai đoạn sớm trước khi cấy vào con cái nhận.

Các nghiên cứu này đã được mở rộng áp dụng trên các đối tượng khác như thỏ, gà, cá, cừu, lợn, trâu bò, dê...

 Thỏ chuyển gen

Thỏ đã được sử dụng làm mô hình thực nghiệm trong các thí nghiệm chuyển gen. Việc tạo ra thỏ chuyển gen thành công đã được công  bố vào năm 1985 với gen chuyển là hormone sinh trưởng có cấu trúc MT-hGH (Hammer, 1985;  Brem, 1985). Tỉ lệ các hợp tử thỏ bị thoái hoá do vi tiêm là dưới 10% (Ross,1988). Khả năng phát triển của các phôi đã vi tiêm trước khi chuyển ghép hợp tử là thấp hơn đáng kể so với các phôi đối chứng.

Hiện nay thỏ là đối tượng chuyển gen nhằm mục đích tạo ra protein quí sử dụng trong y dược thông qua tuyến sữa bởi các lý do sau đây:

- Giá phôi thỏ thấp nên có thể tạo ra một lượng lớn thỏ chuyển gen. Ðiều này đã cung cấp cho các nhà nghiên cứu tăng đáng kể khả năng tạo ra được một hoặc vài dòng thỏ chuyển gen sản xuất ra protein hoạt động sinh học với số lượng đầy đủ.

- Thời gian mang thai của thỏ ngắn và thành thục sinh dục nhanh vì vậy cho phép tạo ra dòng thỏ chuyển gen nhanh hơn so với các động vật chuyển gen khác như dê, cừu hoặc bò...

- Giá sản xuất thấp.

- Về mặt di truyền, thỏ gần với người hơn bất kỳ động vật cho sữa nào khác do vậy nó là mô hình được chọn cho việc sản xuất các protein chữa bệnh ở người đặc biệt là các protein phức tạp.

- Không truyền các bệnh nghiệm trọng do virus gây ra cho người.

- Một thỏ cái có thể tiết một lượng sữa lên đến 250ml sữa mỗi ngày. Trong qui trình chuẩn, mỗi ngày chỉ có 100-150ml sữa được lấy từ một thỏ cái điển hình, tương đương với 15 lít mỗi năm đối với một thỏ cái.

- Lượng protein tái tổ hợp trong sữa thỏ chuyển gen biến đổi từ 1-10g trong một lít.

Các loại protein có thể được sản xuất trong sữa thỏ là các kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody), vaccin...  

Vào năm 2001, Eduardo Kac, giáo sư thuộc Học viện Nghệ thuật Chicago, Mỹ đã kết hợp với các nhà Di truyền học Pháp đã tạo một con thỏ chuyển gen có khả năng phát ra ánh sáng màu lục ở trong tối bằng cách vi tiêm gen mã hoá protein huỳnh quang màu xanh lá cây có nguồn gốc từ sứa vào hợp tử thỏ (Hình 2). Ðây là hướng nghiên cứu mới phục vụ cho mục đích nghệ thuật. “Nó là một vật để cho hoạ sĩ thí nghiệm trên nền của khung vẽ và hoàn toàn khác với thí nghiệm để tạo ra một sự sống“. Nhiều nhà nghệ thuật khác đang nghiên cứu Công nghệ Sinh học và ý nghĩa xã hội của nó mà không nhằm mục đích tạo ra động vật chuyển gen.

Elba, thỏ chuyển gen protein huỳnh quang màu xanh lá cây

Lợn chuyển gen

Năm 1985, Hammer và cộng sự đã công bố tạo được lợn chuyển gen GH bằng phương pháp giống như đã được sử dụng để tạo ra chuột “khổng lồ“ từ năm 1982.

Khác với chuột, các hợp tử của lợn phải được ly tâm để nhìn thấy tiền nhân. Sau khi ly tâm, khoảng 50% hợp tử phát triển in vivo đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc phôi nang (blastocyst). Các hợp tử vi tiêm, 10 - 20% phát triển đến các giai đoạn phôi khác nhau. Trong số các hợp tử vi tiêm thì 5,6 - 11% số hợp tử đã phát triển và tạo thành lợn con. Tỉ lệ hợp nhất gen ngoại lai vào DNA của con chủ là khoảng 10%. Các gen hormone sinh trưởng sử dụng trong các thí nghiệm đầu tiên đã cho tỉ lệ biểu hiện 50%. Sự di truyền Mendel đơn giản đã được chứng minh với các dòng tế bào mầm được chuyển gen. Mức độ biểu hiện được duy trì trong những lần sinh sản tiếp theo. Cấu trúc và biểu hiện của các gen chuyển đã được nhiều tác giả công bố.

Các gen ngoại lai được sử dụng để chuyển vào lợn là mMT-hGH (mouse methallothionein-human growth hormone), mMT-bGH (mouse methallothionein-bovin growth hormone), mMT-pGH (mouse methallothionein-porcine growth hormone), PRL-bGH (prolactin-bovin growth hormone), Alb-hGRF (albumin-human growth hormone releasing factor), mMT-hiGF1 (methallothionein-human insulin like growth factor 1). Lợn chuyển gen mMT- hGRF (mouse methallothionein-human growth hormone releasing factor)  cho tỉ lệ biểu hiện 29%. Lợn chuyển gen mMT - hGH và mMT - bGH cho tỉ lệ biểu hiện tới 61%. Số lượng những bản gen lạ tìm thấy ở DNA genome của con chủ là rất khác nhau, từ 1 - 500 bản sao trong một tế bào đối với lợn chuyển gen mMT-hGH, 1-28 đối với mMT-bGH, 1-15 đối với mMT-pGH  và 10 đối với PRL-bGH.

Những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng sinh lý của sự biểu hiện gen lạ cho thấy có sự tăng hormone sinh trưởng ở lợn chuyển gen hGH và bGH. Sự tăng hormone đó làm thay đổi sinh lý của cơ thể động vật. Người ta thấy có sự phân phối lại trọng lượng giữa các thành phần của vật nuôi như cơ, da, xương và các bộ phận khác. Lợn chuyển gen mMT - bGH thì giảm độ ngon nhưng tăng trọng lượng cơ thể.

Cừu chuyển gen

Ðối với cừu khi vi tiêm không cần thiết phải ly tâm phôi để nhìn thấy tiền nhân. Khả năng phát triển in vivo của hợp tử cừu vi tiêm (10%) và không vi tiêm (26%) bằng một nửa phôi lợn sau khi xử lý tương tự. Sau 7 ngày nuôi cấy in vivo các hợp tử cừu không vi tiêm, Rexroad và Wall (1987) đã quan sát được tỉ lệ phát triển là 86%. Một thí nghiệm nuôi cấy in vivo trong 5 giờ đã giảm tỉ lệ phát triển này xuống còn 65% và sau khi tiêm một dung dịch đệm đã giảm xuống đến 42%. Sau khi vi tiêm dung dịch DNA, 19% số hợp tử phát triển đến giai đoạn 32 tế bào. Ở những thí nghiệm đầu tiên, tỉ lệ hợp nhất là khoảng 1% trong khi tỉ lệ sống sót của phôi vi tiêm đến con non là 7% và 6,2% (theo Brem, 1991).

Các gen GH đã được sử dụng để chuyển vào cừu. Ngoài các gen GH như đã dùng để chuyển vào lợn (mMT-hGH, mMT-bGH, PRL-bGH , mMT-hGRF), người ta còn sử dụng các gen sMT-sGH 5(sheep methallothionein-sheep growth hormone 5), sMT-sGH 9(sheep methallothionein-sheep growth hormone 9). Các kết quả thu được không được tốt như ở lợn. Chỉ có cừu chuyển gen sMT-sGH cho tỉ lệ mỡ thấp hơn so với cừu đối chứng. Người ta cho rằng các tổ hợp MT-gen chuyển không có khả năng cảm ứng với các kim loại nặng khi cừu ăn vào. Mặt khác cũng có thể do ở cừu thiếu các yếu tố nội bào thích hợp cho sự cảm ứng, cho sự tái sắp xếp các gen chuyển và cho sự tích hợp gen chuyển vào genome của tế bào chủ ở các vị trí thuận lợi. Bên cạnh các gen hormone sinh trưởng, một số các gen khác cũng đã được chuyển vào cừu như gen mã hoá yếu tố đông máu IX , gen α1-antitripsin, gen cysE, gen cysK.

Dê chuyển gen

Một thử nghiệm cũng đã được thực hiện để tạo ra gen chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm vào hợp tử đã ly tâm (Armstrong và cộng sự, 1987; Fabricant và cộng sự, 1987). Tỉ lệ dê con cho sữa chuyển gen sinh ra là 5 - 10%. Một số protein dược phẩm đã được biểu hiện ở sữa dê chuyển gen .

 Bò

Giống như lợn, tiền nhân của hợp tử bò được thấy rõ nhờ ly tâm. Lohse, robl và First (1985) đã tiêm gen thymidine - kinase vào hợp tử bò và đã thấy rằng, 24 giờ sau khi tiêm khoảng 30% phôi có thymidine - kinase. Roschlaw và cộng sự (1988) đã vi tiêm 513 hợp tử bò với 3 cấu trúc gen khác nhau có nguồn gốc từ virus và đã tìm thấy DNA ngoại lai trong 14 phôi. Loskutoff và cộng sự (1986) đã thu được 3 thai sau khi tiêm 72 hợp tử và 17 phôi ở giai đoạn 2 tế bào. Mc. Evoy và cộng sự (1987) đã thu được 4 thai sau khi chuyển 43 hợp tử vi tiêm và 8 trứng ở giai đoạn 2 tế bào vào 17 thể nhận. Church, Mc. Rae và Mc. Whir (1986) đã tiêm 852 hợp tử bò với gen alpha-fetoprotein và thấy 4 phôi có sự hợp nhất gen trong số 111 phôi phát triển.

Trong thí nghiệm vi tiêm hợp tử bò, tỉ lệ bê con sinh ra từ phôi vi tiêm là 19,9%, tương ứng với các phôi đối chứng không vi tiêm là 42,8%. Theo Church và cộng sự (1987) thì 7 trong 126 bê con vi tiêm (5,6%) DNA ngoại lai đã hợp nhất với DNA genome. Biery, Bondioli và Mayo (1988) đã đạt được tỉ lệ hợp nhất từ 0,22 - 1,76% số hợp tử vi tiêm.

 Gà chuyển gen

Gà chuyển gen được phát triển nhằm các mục đích chủ yếu: phát triển, cải tiến các phương pháp và kỹ thuật thí nghiệm; sản xuất dược phẩm và các protein khác trong trứng để sử dụng trong y học người và vật nuôi; nhận biết và khai thác các tính trạng sinh học có lợi cho sản xuất thịt gia cầm; nghiên cứu sự phát triển phôi.

Phát triển, cải tiến các phương pháp và kỹ thuật thí nghiệm

Không như các động vật khác,việc nghiên cứu chuyển gen ở gà gặp phải một số hạn chế nhất định. Ở động vật có vú và cá, trứng là một tế bào có tiền nhân có thể được nhìn thấy để vi tiêm DNA ngoại lai vào. Trong khi đó trứng gà ngay khi vừa được đẻ ra phôi đã bắt đầu phát triển ở noãn hoàng và chứa khoảng 50.000-60.000 tế bào.

Vào giữa thập niên 1980, một nhà nghiên cứu ở Viện Sinh lý học Ðộng vật và Di truyền ở Edinburgh đã vi tiêm DNA ngoại lai vào các tế bào phôi gà đơn lẻ. Các phôi được chuyển từ ống dẫn trứng của gà mái đặt vào trong các bình chứa các dung dịch tương tự như ở trong trứng. Sau đó mỗi một phôi được chuyển vào trong một vỏ trứng nhân tạo, hàn gắn lại bằng keo được chế tạo từ lòng trắng trứng và thuốc kháng sinh. Các trứng này được đem ấp nhân tạo. Kết quả là các chú gà con ra đời. Tạp chí New Scientist đã gọi chúng là các “gà con ống nghiệm” đầu tiên trên thế giới cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra “gà siêu hạng” bằng cách xen DNA ngoại lai vào phôi.

Vào năm 1993, một nghiên cứu về khả năng của gan gà để biểu hiện protein tái tổ hợp in vivo. Nghiên cứu này được thiết kế để đánh giá sự sử dụng gan gà “tác động đến tốc độ sinh trưởng, sự chuyển hoá, thành phần cấu tạo mỡ cơ thể và hiệu quả của các loại thuốc khác nhau” và để nghiên cứu mô hình chữa bệnh di truyền người. Trong thí nghiệm này, gen kháng neomycin tái tổ hợp của chuột được gắn với vector retrovirus leukosis gà và được đưa vào phôi.

Vào năm 1994, một phương pháp tạo gà chuyển gen bằng vi tiêm DNA ngoại lai từ hai loại vi khuẩn khác nhau đã được mô tả. Trước tiên gà mái được thụ tinh nhân tạo với tinh dịch của gà trống khoẻ mạnh. Sau đó giết chết gà mái bằng cách tiêm vào tĩnh mạch của nó chất gây mê với liều cao. Mổ bụng gà mái đã chết và di chuyển bộ phận ống dẫn trứng chứa trứng thụ tinh không vỏ. Sau đó đặt trứng vào các vỏ thay thế và tiêm DNA plasmid vi khuẩn vào đĩa phôi của hợp tử (phôi 1 tế bào). Ðổ đầy vỏ trứng dung dịch nuôi cấy và hàn gắn lại. Tiếp theo là phân tích tình trạng của DNA plasmid đã tiêm vào đĩa phôi tối thiểu sau 12 ngày trong môi trường. Với 128 trứng vi tiêm, 7 gà con vi tiêm sống đến thành thục sinh dục. Trong đó 1 gà trống đã truyền DNA plasmid vi khuẩn cho 3,4% con cái của nó. Các gà con chuyển gen này sống đến thành thục sinh dục và được nhân giống để sản xuất gà chuyển gen. Kết quả này chứng tỏ sự di truyền DNA ngoại lai ổn định có thể đạt được bằng phương pháp này.       

Mục đích của một nghiên cứu được công bố vào năm 1995 trong tạp chí Transgenic Research là để phát triển một hệ thống vector retrovirus an toàn cho việc tạo gà chuyển gen. Vấn đề là trong thực tế sự tái bản in vivo của virus gà được sử dụng có thể gây bệnh sau một thời gian dài. Nó làm tăng nguy cơ tình trạng nhiễm virus mãn tính. Virus hoại tử lách gà (ANV=Avion Necrosis Virus) là tương đối gần gũi với retrovirus động vật có vú và vì vậy có thể thấy rằng ANV có thể nhiễm cho tế bào người. Các nhà nghiên cứu đã tìm ra một phương pháp tạo gà chuyển gen bằng cách sử dụng các vector tái bản đã sửa đổi dựa trên một hệ thống ngoại hướng (ecotropic system) mà làm cho nó chỉ có thể nhiễm vào tế bào gà.

Sử dụng vector có nguồn gốc từ virus leukosis của chim (ALV= Avion Leukosis Virus), các nhà nghiên cứu đã tiêm gen ngoại lai vi khuẩn vào khoang dưới đĩa mầm của phôi gà không ấp. Sau đó tách chiết DNA từ các phôi này và đem tiêm vào một nhóm phôi gà không ấp khác. Trứng vi tiêm được đem ấp. Trong số 1550 trứng gà vi tiêm gen gắn với vetor ngoại hướng được đem ấp thì chỉ có 36 trứng nở. Theo các nhà nghiên cứu, phần lớn phôi chết sớm sau khi vi tiêm chủ yếu là do việc mở vỏ trứng của chúng. Một gà trống chuyển gen thành thục sinh dục sống sót được truyền gen cho thế hệ sau với tần số 2,2%.

Vào năm 2002, các nhà nghiên cứu của Công ty AviGenics và Khoa Di truyền của trường Ðại học Georgia ở Athens đã tìm ra một hệ thống vector ALV có giá trị hơn đối với việc tạo gà chuyển gen cũng như để phát triển cách nhận diện thế hệ sau chuyển gen một cách nhanh chóng với các phương pháp ít tốn công sức hơn. Họ đã sản xuất được 3 đàn gà mang gen chuyển (với hệ thống vetor ALV) hợp nhất, ổn định và đã truyền lại cho các thế hệ sau. Gần 5% gà trống sinh ra từ phôi vi tiêm được sử dụng để nhân giống. Các gà trống này đã truyền gen lại cho con cháu với tần số 1%.

Sản xuất dược phẩm và các protein khác trong trứng để sử dụng cho y học người và vật nuôi

Trong lĩnh vực này, gà mái và trứng của chúng đang được sử dụng như là các nhà máy sản xuất protein và kháng thể. Các nhà khoa học đã tạo ra gà chuyển gen có thể sản xuất protein trong trứng. Ðây là một bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái có thể đẻ những “quả trứng vàng” mà thuốc được đóng gói trong đó. Sản xuất thuốc trong lòng trắng trứng có nhiều lợi thế. Gà có thể đẻ nhiều thế hệ trong một thời gian ngắn. Một thế hệ của gà là khoảng 6 tháng, ngắn hơn rất nhiều so với các động vật có vú lớn như dê chẳng hạn phải cần 18 tháng sinh trưởng từ phôi chuyển gen mới có khả năng cho sữa. Gà cũng sản xuất được nhiều protein, hàng năm mỗi gà mái có thể đẻ xấp xỉ khoảng 330 quả trứng chứa 6,5 gam các protein khác nhau. Về mặt sinh học thì lòng trắng trứng ít phức tạp hơn sữa và có nhiều phương pháp tách chiết các protein khác nhau từ trứng một cách dễ dàng.  Harvey và cộng sự (2002) thuộc trường Ðại học Georgia ở Athens đã đưa gen mã hoá enzyme beta-lactamase vi khuẩn vào trong phôi của gà Leghorn trắng. Khoảng 2% các phôi này đã sinh trưởng đến thành thục và đã biểu hiện enzyme beta-lactamase trong một số tế bào. Bước tiếp theo, các nhà nghiên cứu đã cho lai các gà bình thường với các gà trống và gà mái đã biểu hiện beta-lactamase trong tinh trùng hay trong trứng của chúng. Thế hệ con sinh ra đã mang các bản sao của gen beta-lactamase ở trong tất cả các tế bào và các gà mái thế hệ con này đã đẻ ra các quả trứng mặc dù nhỏ nhưng có chứa beta-lactamase. Các gen chuyển ổn định trong gà. Mỗi gà mái chuyển gen có thể đẻ trứng chứa enzyme tối thiểu là 16 tháng và gen chuyển hoạt động chức năng tối thiểu qua 4 thế hệ gà mái.

Tuy nhiên, loại virus được sử dụng làm vector hiện nay chỉ có thể mang các gen có kích thước nhỏ vào DNA của gà. Ðây là một vấn đề quan trọng bởi vì trong thực tế nhiều gen hữu ích có kích thước lớn hơn gấp 10 lần so với gen beta-lactamase. Hai hướng nghiên cứu tiếp theo mà các nhà khoa học đang tập trung vào là chuyển các gen mã hoá các protein sử dụng cho chữa bệnh và phát triển các phương pháp để tạo ra nhiều protein ngoại lai duy nhất trong các mô đặc biệt như ống dẫn trứng chẳng hạn.  

Nghiên cứu gà chuyển gen đang được sử dụng để:

- Chế tạo vaccin.

- Sản xuất kháng thể trong trứng. Các kháng thể này được thêm vào trong thức ăn của lợn để để chống nhiễm khuẩn (như E. coli).

- Sản xuất kháng thể thúc đẩy sự sinh trưởng trong noãn hoàng để cung cấp nguyên liệu cho vật nuôi nhằm mục đích tăng tốc độ sinh trưởng của chúng.

- Sản xuất protein tái tổ hợp lactoferrin và lysozym. Ðây là các chất bổ sung với thuốc kháng sinh thúc đẩy sự sinh trưởng hoặc kháng thể trong khẩu phần thức ăn gia cầm.

- Sản xuất kháng thể chống ung thư ở người.

- Tiết ra hormone sinh trưởng người để chữa bệnh lùn.

- Sản xuất trứng có hàm lượng cholesterol thấp hơn phục vụ cho con người.

- Sản xuất isoflavon đậu nành trong trứng để bán cho người tiêu dùng.

- Sản xuất các kháng thể như immoglobulin chim hoặc IgY một cách đặc biệt, thay thế cho việc sử dụng các động vật thí nghiệm.

- Tạo dòng sản xuất gà thịt (broiler). Khi trứng gà mái thịt thụ tinh mang các tế bào “kiểu thịt” thì sẽ cho phép tạo dòng gà thịt. Trong chương trình này, các cá thể nhất định từ các đàn gà phả hệ sẽ được tạo dòng và vật chất di truyền được đưa vào trong trứng thụ tinh. Các nhà khoa học nuôi cấy tế bào mang gen ngoại lai và sau đó đưa các tế bào này vào trong phôi của trứng nhận đã thụ tinh và tạo ra được gà thể khảm. Trứng nhận đã thụ tinh có thể thu thập từ các đàn gà như Leughorn chẳng hạn. Gà Leughorn có thể sinh sản một số lượng lớn trứng với giá thành không đắt. Khi các trứng chuyển gen này được ấp nở sẽ thu được gà thịt.

Nhận biết và khai thác các tính trạng sinh học có lợi cho sản xuất thịt gia cầm

Vào đầu thập niên 1990, Công ty Merck- một trong những công ty gia cầm lớn nhất trên thế giới đã đăng ký bằng sáng chế Châu Âu về gà chuyển gen hormone sinh trưởng bò dưới cái tên “gà vĩ mô” (Macro Chicken).

Trong lúc đó các nhà Di truyền học đang nghiên cứu một gen giảm mỡ để xen vào gà broiler bởi vì tốc độ sinh trưởng nhanh đã làm tăng số lượng tế bào mỡ ở những con gà này. Ở giai đoạn 6 tuần tuổi, gà chuyển gen hormone sinh trưởng có tốc độ sinh trưởng nhanh gấp 3,5 lần so với gà  bình thường. Nhưng tỉ lệ tử vong của gà mái đẻ chuyển gen là gấp 7 lần và hơn 2% gà chuyển gen chết do suy tim ở giai đoạn đầu của sự phát triển. Tối thiểu 1/4 gà broiler bị què và các nghiên cứu cho thấy rằng chúng bị đau. Với nhiều vấn đề gây nên do sự sinh trưởng với tốc độ mạnh mẽ của gà chuyển gen hormone sinh trưởng như vậy, ngành kỹ nghệ gia cầm đang xem xét các phương pháp sửa đổi di truyền khác để nhân giống gà cho thị trường thế giới. Trong thế kỷ 21 này, chắc chắn các công ty giống sẽ trở nên ngày càng quan tâm đến các tính trạng khác hơn là tốc độ sinh trưởng. Các công ty Công nghệ Sinh học cho rằng các kế hoạch của họ không chỉ tăng số lượng gà nuôi để giết thịt mà còn rút ngắn thời gian sinh trưởng của gà hoặc ngay cả việc gà có trọng lượng cơ thể lớn hơn.

Nghiên cứu sự phát triển phôi

Vào năm 2003, các nhà khoa học gia cầm trường Ðại học North Carolina đã phát triển một công cụ mới hữu dụng để hiểu được phôi gà phát triển như thế nào.

Các nhà nghiên cứu đã thành công khi chuyển gen vào gà và tạo ra được một dòng gà mang gen marker đặc hiệu. Hiện nay các phôi gà chuyển gen này được sử dụng như là một mô hình để hiểu được sự phát triển của phôi bình thường và phôi không bình thường. Các dòng gà chuyển gen mới này được sử dụng trong các nghiên cứu với mục đích tìm hiểu các khuyết điểm sinh sản như tình trạng biến dạng của chi, tật nứt đốt sống . Các nhà nghiên cứu cho rằng việc hiểu các cơ chế phía sau các tế bào hoạt động có tốt không trong quá trình phát triển của phôi cuối cùng có thể cung cấp manh mối để làm ngừng sự phát triển của bệnh tật và có thể dẫn đến nhiều hữu ích khác kể cả việc cải tiến sức khoẻ của con người và động vật.

Gà chuyển gen để nghiên cứu quá trình phát triển phôi

Các nhà nghiên cứu đã tạo ra gà chuyển gen bằng cách vi tiêm gen lacZ với một tín hiệu định vị ở nhân (gen lacZ dễ phát hiện và biểu hiện protein ß-galactosidase) được nối với vector retrovirus SNTZ vào khoang dưới đĩa phôi hoặc lớp tế bào trên bề mặt của noãn hoàng của trứng vừa mới đẻ. Sau đó trứng được ấp nở và gen lacZ được phát hiện bằng phản ứng PCR. 8 trong số 15 gà trống vi tiêm sống đến thành thục sinh dục mang gen lacZ ở trong tinh trùng. Các gà trống này được đem lai với gà mái bình thường không chuyển gen. Một trong 8 gà trống mang gen lacZ được đem lai đã tạo ra được 224 gà thế hệ F1, trong đó có 2 gà trống mang gen lacZ, chiếm tỉ lệ 0,89%. Hai gà trống F1 này được đem lai với gà mái bình thường tạo ra thế hệ F2. 46,5% gà F2 mang gen lacZ như mong đợi đối với một alen trội đồng hợp tử. Sản phẩm của gen lacZ là ß-galactosidase định vị ở nhân được biểu hiện ở môi trường nuôi cấy nguyên bào sơ cấp có nguồn gốc từ gà F2 và nó cũng được biểu hiện trong toàn bộ phôi gà F2. Ðây là lần đầu tiên một dòng gà chuyển gen biểu hiện ß-galactosidase đã được phát triển.

Khỉ chuyển gen

Như chúng ta đã biết, nguyên tắc của tinh trùng trong quá trình thụ tinh là chuyển genome đơn bội của mình vào trứng để tạo thành hợp tử. Khả năng này đã được khai thác như là một  chiến lược đổi mới sự phân phát DNA ngoại lai đối với sự sinh sản của động vật chuyển gen. Bằng phương pháp vi tiêm tinh trùng mang plasmid tái tổ hợp một cách trực tiếp vào tế bào chất của trứng (intracytoplasmic sperm injection =ICSI), các nhà khoa học thuộc Trường Ðại học Khoa học Sức khoẻ Oregon, Mỹ đã tạo ra các phôi biểu hiện gen chuyển ở khỉ rhesus. Plasmid tái tổ hợp được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm gen marker mã hoá protein huỳnh quang màu xanh lá cây GFP (green fluoenscent protein) kết hợp với promoter CMV (cytomegalovirus). Gen GFP được tách chiết lần đầu tiên từ các con sứa có màu sắc sặc sỡ và là gen  được các nhà nghiên cứu ưa chuộng vì khi GFP được tạo ra với số lượng đầy đủ chúng sẽ phát ra ánh sáng màu xanh. Các phôi biểu hiện GFP đã được tạo ra bằng phương pháp ICSI mặc dù không thông qua thụ tinh nhân tạo. Tinh trùng của khỉ rhesus vẫn mang plasmid tái tổ hợp sau khi vi tiêm vào trong khỉ thành thục sinh dục. Sự biểu hiện GFP thể khảm đã được phát hiện ở giai đoạn 1-4 tế bào. Số lượng tế bào phôi và tỉ lệ % phôi biểu hiện ngày càng tăng lên trong sự phát sinh phôi cho tới giai đoạn túi phôi. Cả khối tế bào phôi bên trong và ngoại phôi bì dinh dưỡng (trophectoderm) đều cho thấy huỳnh quang màu xanh của GFP. Từ 7 phôi chuyển gen đã tạo thành 3 khỉ con: một cặp sinh đôi bình thường gồm một đực và một cái bị sinh thiếu 35 ngày và đã chết yểu; một con đực sức khoẻ tốt sinh đúng thời hạn được đặt tên là “George“. Kết quả này chứng tỏ rằng với phương pháp ICSI, tinh trùng khỉ mang DNA ngoại lai vẫn duy trì khả  năng sinh sản của chúng một cách bình thường. Tuy nhiên, về mặt lý thuyết các nhà khoa học vẫn lo lắng rằng phương pháp này có thể truyền thêm vật chất di truyền cho thế hệ sau do nhiễm từ bên ngoài vào một cách tình cờ (ví dụ như nhiễm virus và vi khuẩn).

Bằng phương pháp chuyển gen nhờ vector là virus, các nhà khoa học thuộc Trường Ðại học Khoa học Sức khoẻ Oregon, Mỹ cũng đã tạo ra được một một chú khỉ rhesus chuyển gen khác có tên là ANDi (inserted DNA=iDNA nhưng được đảo ngược) được sinh vào ngày 2 tháng 10 năm 2000. Ở đây, một vector virus không lây nhiễm đã được sử dụng để mang gen GFP vào trứng của khỉ mẹ một cách trực tiếp. Sau đó vector virus này bám vào bề mặt của trứng và bị mất đi còn gen GFP tiếp tục con đường của nó để đi vào nhiễm sắc thể của mẹ. Các trứng chuyển gen này sẽ được thụ tinh nhân tạo. Phôi thụ tinh thu được sẽ được đưa vào các con mẹ thay thế.

Các nhà nghiên cứu đã chuyển gen GFP vào 224 trứng. Sau khi các trứng thụ tinh tạo ra 40 phôi và hình thành nên 5 bào thai. Trong đó chỉ có 3 bào thai sống sót và cuối cùng duy nhất chỉ một chú khỉ chuyển gen thành công là ANDi. Tuy nhiên ANDi không phát sáng trong tối (Hình 4).

ANDi - chú khỉ rhesus chuyển gen được chào đời vào ngày 2 tháng 10 năm 2000

Với phương pháp này các nhà khoa học hy vọng sẽ lấp được  chỗ trống khoa học giữa chuột chuyển gen và người.  Kết quả thu được đã cung cấp một công cụ nghiên cứu đầy tiềm năng và hữu hiệu để khám phá nguyên nhân của các bệnh như ung thư, Parkinson, Alzheimer, tiểu đường, tim mạch, các bệnh về trí tụê... Nghiên cứu này cũng cho thấy một bước mới trong hướng liệu pháp gen dòng mầm (germ line genetic therapies). Các gen xác định các vấn đề di truyền có thể được đưa một cách trực tiếp vào trứng người chưa thụ tinh của cơ thể mẹ được biết mang các gen bệnh nhất định. Cho đến nay tất cả các nghiên cứu liệu pháp gen của người đã được giới hạn để tập trung vào các mục tiêu tế bào ở đó các gen được đưa vào không trở thành một bộ phận của genome.

Muỗi chuyển gen

Theo Tổ chức Sức khoẻ Thế giới (The World Health Organization), hàng năm, bệnh sốt rét đã ảnh hưởng đến khoảng 500 triệu người trên trái đất. Nguyên nhân gây ra bệnh là do ký sinh trùng sốt rét. Ký sinh trùng sốt rét được truyền từ muỗi cái. Nó gây sốt, co cứng cơ, đổ mồ hôi, run và đã cướp đi 2 triệu sinh mạng mỗi năm, trong đó phần lớn là trẻ em Châu Phi dưới 5 tuổi. Trong khi các phương pháp thông thường để kiểm soát bệnh sốt rét đã không còn có hiệu quả như trước đây cho nên sự ra đời một biện pháp mới là rất cấp thiết .

Vào năm 2000, các nhà khoa học ở Học viện Hoàng gia London và Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử Châu Âu lần đầu tiên trên Thế giới đã thành công trong việc đưa một gen ngoại lai vào genome của muỗi Anopheles stephensi và đã tạo ra muỗi chuyển gen.

Thành tựu này có ý nghĩa rất lớn, giúp các nhà khoa học đi đến một bước gần hơn để tạo ra muỗi không truyền bệnh sốt rét. Nói cách khác, sự truyền căn bệnh quái ác này có thể được kiểm soát thông qua sự thao tác trên các gen của muỗi để phá vỡ sự tương tác qua lại giữa muỗi với ký sinh trùng sốt rét, bằng cách tạo ra một môi trường ở trong cơ thể muỗi mà có thể ngăn cản ký sinh trùng sốt rét sống ở đó. Cũng có thể thay đổi tập tính của muỗi làm cho nó thích hút máu động vật hơn máu người hoặc tạo ra muỗi bất dục đực một cách chọn lọc để làm giảm quần thể muỗi. Các nhà khoa học đều nhất trí về tiềm năng to lớn của sự phát triển này để chống lại bệnh sốt rét và cho rằng trong thời gian tới muỗi chuyển gen sẽ được tạo ra ổn định, an toàn và không có khả năng truyền bệnh sốt rét.

Các nhà nghiên cứu đã xen vào phôi A. stephensi gen mã hoá protein huỳnh quang màu xanh lá cây- GFP (green fluorescent protein) sử dụng một yếu tố vận động của Drosophila hydei. Gen mã hoá protein này được sử dụng bởi vì nó hoạt động như là một marker và GFP tạo thành có khả năng được nhìn thấy dễ dàng dưới tia UV để nhận biết muỗi đã được tích hợp thành công gen ngoại lai.

Sự biểu hiện GFP của ấu trùng vi tiêm là cao, chiếm gần 50% số ấu trùng sống sót sau khi vi tiêm. Tuy nhiên, đến giai đoạn trưởng thành thì chỉ còn khoảng 10%. Sự xâm nhập vào nhiễm sắc thể và sự di truyền của gen GFP cho thế hệ sau cũng được chứng minh một cách chi tiết.

Một vấn đề khó khăn gặp phải trong nghiên cứu này là các quả trứng muỗi vừa mới đẻ trở nên cứng rất nhanh làm cho việc vi tiêm gen vào là rất khó. Chỉ sau khi khám phá ra dung dịch p-nitrophenol p-guanidinobenzoate (pNpGB), một hợp chất làm chậm tốc độ cứng và không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi muỗi thì mới có thể tiến hành đưa gen ngoại lai và một cách tự nhiên. Muỗi cái được cho đẻ trứng trong dung dịch pNpGB, chất này sẽ ngăn cản enzyme phenoloxidase, bước đầu tiên trong quá trình melanin hoá.

Vào năm 2002, các nhà nghiên cứu thuộc trường Ðại học Case Western  Reserve (CWRU) ở Cleveland, Ohio, Mỹ đã phát triển một loại muỗi chuyển gen chống sốt rét ở chuột.

Chúng ta biết rằng có nhiều loại muỗi nhưng duy nhất chỉ có giống Anopheles truyền bệnh sốt rét ở động vật có vú. Muỗi là vật chủ bắt buộc đối với ký sinh trùng sốt rét kể từ khi nó không thể truyền trực tiếp từ người sang người. Khi muỗi hút máu một người bệnh, ký sinh trùng Plasmodium xâm nhập vào cơ thể và sinh sản ở ruột giữa của muỗi và tạo thành một dạng trung gian, dạng này xuyên qua vách ruột giữa đến khoang bụng và biến thành nang. Sau khoảng thời gian từ 10-15 ngày, các nang vỡ bung ra, hàng ngàn bào tử được giải phóng. Các bào tử này đi qua vách tuyến nước bọt và sẽ tồn tại ở tuyến này cho đến khi muỗi tiến hành chích người tiếp theo.

Với mục đích tìm ra gen có thể phá hoại quá trình này, nhóm nghiên cứu đã nuôi muỗi A. Stephensi bằng các hạt được phủ các sợi axit amin khác nhau và sau đó kiểm tra xem loại hạt nào dính với màng ruột của muỗi. Bằng cách chọn lọc và phối hợp các nhà khoa học đã tạo ra một hợp chất có khả năng dính rất cao gọi là SM1. Chất này có tác dụng làm giảm một cách có ý nghĩa số lượng ký sinh trùng xuyên qua vách ruột để biến thành nang.

Ðể việc sản xuất SM1 đúng lúc, người ta đã tìm ra gen mã hoá cho một loại enzyme tiêu hoá mà ruột muỗi tiết ra trong khi hút máu và nối nó với một gen được thiết kế để tổng hợp SM1. Sau đó cấu trúc này được đã được vi tiêm vào phôi muỗi A. Stephensi và nó đã tự tích hợp vào genome và trở thành một bộ phận của DNA muỗi. Protein SM1 sau khi được tổng hợp sẽ bám vào bề mặt biểu mô ruột, cạnh tranh với ấu trùng muỗi. Âúu trùng muỗi không có khả năng bám vào ruột sẽ chết. Bằng cách này SM1 đã ức chế khoảng 80% sự phát triển của ấu trùng. Tính trạng này đã được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Mặt khác, muỗi chuyển gen SM1 không bị ảnh hưởng đến sức sống kể cả tuổi thọ và sự sản xuất trứng.

Tuy nhiên các nhà khoa học cảnh báo rằng sự cần thiết phải tiến hành thử nghiệm nhiều hơn nữa để chứng minh phương pháp này là an toàn đối với người.

Trong việc tìm kiếm các gen kháng ký sinh trùng sốt rét, người ta cũng đã thành công khi chuyển gen phospholipase A2 (PLA2) của nọc độc ong vào muỗi A. Stephensi. Gen này được gắn với promoter carboxypeptidase của A. gambiae (AgCP). Kết quả phân tích bằng phương pháp Northern blot cho thấy mRNA của gen PLA2 được biểu hiện một cách đặc hiệu ở ruột của muỗi chuyển gen. Sự biểu hiện cao nhất ở thời điểm 4 tiếng sau khi hút máu. Phân tích Western blot và huỳnh quang miễn dịch đã phát hiện protein PLA2 ở biểu mô ruột giữa của rmuỗi chuyển gen khoảng 8-24 tiếng sau khi hút máu. Nhưng điều quan trọng là sự biểu hiện của gen chuyển đã làm giảm số lượng các nang, trung bình là 87% và làm giảm một cách đáng kể sự truyền ký sinh trùng sốt rét sang chuột. Kết quả này cho thấy gen PLA2 có thể được sử dụng để ngăn cản sự phát triển của ký sinh trùng sốt rét ở muỗi.              

Một hướng nghiên cứu khác đang được tiến hành là ngăn cản sự xâm nhập của ký sinh trùng vào tuyến nước bọt của muỗi. Sự ngăn cản ký sinh trùng xâm nhập vào các thời điểm khác nhau trong quá trình phát triển của nó là rất quan trọng bởi vì không có phương pháp nào là đạt hiệu quả 100% cả.

Các nhà nghiên cứu khác trước đây đã sử dụng một loại virus đã được sửa đổi tiêm vào muỗi để làm ngưng sự lan truyền ký sinh trùng. Nhưng phương pháp này có một số hạn chế là trong thực tế virus cũng có thể nhiễm vào người và virus không thể di truyền được từ thế hệ này sang thế hệ sau ở muỗi. Một khi muỗi chết thì sẽ chấm dứt khả năng của virus chống lại sốt rét.

Một thách thức mà các nhà nghiên cứu đang phải đối mặt đó là sự phát triển của các ký sinh trùng có khả năng kháng. Bởi vì áp lực của quá trình chọn lọc cao, khi một gen được đưa vào quần thể ký sinh trùng sốt rét thì sự phát triển của các dòng kháng có khả năng để xuất hiện. Nó tương tự như khi xử lý sự nhiễm khuẩn với kháng sinh, sau một thời gian vi khuẩn sẽ trở nên kháng thuốc.  Một vấn đề được đặt ra là sự sử dụng gen phức (multiple genes), trong đó mỗi một gen ngăn cản sự phát triển của ký sinh trùng một cách khác nhau là một phương pháp hiệu quả hơn.           

Sau khi tạo ra muỗi chuyển gen, chiến lược tiếp theo để khắc phục sốt rét là đưa dòng muỗi chuyển gen kháng ký sinh trùng sốt rét vào trong tự nhiên. Phương pháp này phải được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm một cách cẩn thận để kiểm tra xem muỗi chuyển gen sống như thế nào khi được trộn chung với các quần thể muỗi không chuyển gen.

Kết quả nghiên cứu quần thể muỗi chuyển gen đầu tiên trong phòng thí nghiệm đã được các nhà khoa học thuộc Học viện Hoàng gia London công bố bố vào năm 2003.

Các nhà nghiên cứu đã chuyển gen marker huỳnh quang đỏ hoặc xanh vào 4 dòng muỗi A. stephensi. Ở các quần thể đối chứng bao gồm toàn muỗi chuyển gen, marker huỳnh quang đã duy trì một cách nguyên vẹn qua hơn 30 thế hệ. Nhưng khi muỗi chuyển gen được nhân giống với muỗi bình thường thì số lượng muỗi mang marker trong quần thể giảm mạnh và trong một số thí nghiệm gen marker biến mất hoàn toàn trong khoảng từ thế hệ thứ 4 đến thế hệ thứ 16. Giáo sư Charles Godfray-Giám đốc Trung tâm Hội đồng nghiên cứu môi trường tự nhiên về Sinh học Quần thể (NERC) của Hoàng gia đã thực hiện mô hình toán học về động lực học của quần thể muỗi. Nghiên cứu này cho phép khảo sát tỉ mỉ các quá trình khác mà có thể giải thích được sự hoạt động của muỗi chuyển gen trong quần thể hỗn hợp. Tác giả cho rằng, thông qua sự nhân giống của muỗi chuyển gen, gen chuyển có khả năng bị một hoặc nhiều đột biến có hại. Các đột biến có hại này không giết chết muỗi nhưng làm cho chúng thua thiệt trong sự cạnh tranh với muỗi bình thường. Vấn đề này có thể được hạn chế bằng cách sử dụng các chế độ lai làm giảm đến mức tối thiểu các ảnh hưởng của giống. Như vậy hoạt động của muỗi chuyển gen không ảnh hưởng lớn đến khả năng tồn tại của chúng.

Sự nghiên cứu các quần thể này quyết định hoàn toàn các quá trình điều chỉnh cũng như đánh giá sự an toàn và hậu quả môi trường của phương pháp mới này. Nó còn giúp đánh giá một cách toàn bộ tính khả thi của việc sử dụng muỗi chuyển gen để chống lại các bệnh tật như sốt rét, sốt vàng da, sốt xuất huyết và đóng vai trò là một bộ phận quan trọng trong các chiến lược phát triển trong tương lai để góp phần trục xuất các tai họa gây ra sự khổ sở cho nhân loại.

Vi tiêm DNA vào phôi giai đoạn sớm của muỗi gây sốt vàng da

Ấu trùng muỗi nhìn dưới kính hiển vi

Cá chuyển gen

Hiện nay nghiên cứu tạo cá chuyển gen ngày càng được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm. Khoảng 10 năm trở lại đây hàng loạt cá chuyển gen đã được tạo ra: cá hồi cầu vồng, cá hồi, cá rô phi, cá vàng, cá mú vằn, cá medaka, cá chép, cá nheo Mỹ, cá trê châu Phi, cá vền biển (seabream), cá hồi chấm hồng Bắc cực (Arctic charr). Những gen ngoại lai được sử dụng để biến nạp vào cá là gen hormone sinh trưởng (GH) người, gen GH bò, gen GH cá, gen δ-crystalline gà, gen ß-galactosidase vi khuẩn, gen kháng hygromycin, gen α-globin, gen protein chống lạnh ở cá, gen neomycin phosphotransferase (neo)... Ví dụ Mc. Envoy và cộng sự đã chuyển gen ß-galactosidae  vào cá hồi Ðại tây dương (Atlantic salmon), Ozato và cộng sự (1986) đã chuyển gen δ-crystalline gà vào cá medaka, Zhang và cộng sự (1989) đã chuyển gen GH cá hồi cầu vồng vào cá chép và cá trê. Trong cả ba trường hợp này gen ngoại lai đã được biểu hiện trong một số cá biến nạp.

Trong một số trường hợp, các sản phẩm sinh ra từ gen ngoại lai ở động vật chuyển gen có thể làm biến đổi kiểu hình của chúng. Ở cá chép chuyển gen GH cá hồi cầu vồng, polypeptid GH cá hồi cầu vồng đã được tìm thấy trong cá chép và do đó chúng lớn lên rất nhanh so với cá đối chứng. Những kết quả này cho thấy tiềm năng to lớn của việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen để đưa các gen quy định các tính trạng mong muốn vào một số loài cá quan trọng.

Có nhiều phương pháp khác nhau để chuyển gen cho động vật nói chung và cá nói riêng. Phương pháp có hiệu quả nhất là vi tiêm trực tiếp DNA vào phôi. Gần đây người ta cũng đã thử nghiệm thành công chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng trước khi cho thụ tinh. Muller F. và cộng sự (1992) lần đầu tiên công bố đã thành công trong việc sử dụng các tế bào tinh trùng đã xung điện để tạo cá chuyển gen. Phương pháp này được tiến hành bằng cách ủ tế bào tinh trùng cá trong dung dịch citrate loãng với DNA plasmid. Tiếp theo sử dụng xung điện có cường độ và điện trường cao để tăng lượng DNA xâm nhập vào tinh trùng. Tách chiết dịch mô và DNA genome của cá bột phát triển từ trứng thụ tinh với tinh trùng đã xử lý để kiểm tra hiệu quả của gen chuyển. Bằng phương pháp lai phân tử Dot blot và thử nghiệm sự biểu hiện của gen đã chứng minh sự có mặt và biểu hiện của gen ngoại lai trong 2,6 - 4,2% số cá bột của cá chép thường (Cyprinus carpio L.), cá trê Châu Phi (Clarias gariepinus) và cá rô phi (Oreochromis niloticus). Không có gen chuyển nào được tìm thấy trong cá bột thu được từ các thí nghiệm tương tự nhưng không xung điện tinh trùng.

Inoue (1992) đã chuyển gen vào phôi và cá bột thành công bằng phương pháp xung điện. Zuoyan Zhu (1993) cũng đã thành công trong việc chuyển gen ngoại lai vào cá bằng phương pháp biến nạp bằng xung điện: tổ hợp gen MThGH được chuyển vào trứng cá thụ tinh đã được loại bỏ màng chorion. Thông số biến nạp tối ưu là 250V / 22 µF / 20Ω / 1ms. Kết quả đạt được là khoảng 10% số trứng nở và phát triển cá thành cá chạch chuyển gen. Muller và cộng sự (1993) đã dùng gen luciferase đom đóm và lacZ của E. coli, cả hai gen này đều được gắn với promoter CMV-IE1, để chuyển vào trứng thụ tinh đã loại bỏ màng chorion của cá trê Châu Phi và cá mú vằn bằng phương pháp xung điện. Kết quả đạt được khoảng 25 - 50% phôi đã phát triển thành cá chuyển gen.

Anderson và cộng sự (1996) đã thành công trong việc chuyển gen trực tiếp vào cơ vân của cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss). Gen ngoại lai được sử dụng là gen luciferase đom đóm gắn với promoter CMV-IEP (cytomegalovirus immediate early promoter). Sự biểu hiện của gen được phát hiện trong các tế bào cơ dọc theo đường tiêm và các tế bào cơ phân tán trước vị trí tiêm. Tan và cộng sự (1997) đã chuyển gen chloramphenicol acetyltransferase (CAT) trực tiếp vào cơ vân cá mú vằn (zeabrafish) sử dụng plasmid pCMV-CAT1. Sự hoạt động biểu hiện của gen CAT đạt cực đại tương quan với lượng plasmid tiêm vào là 5 µg pCMV-CAT1. Sự hoạt động của gen CAT tăng lên một cách đều đặn qua 7 ngày đầu sau khi tiêm, với mức biểu hiện cao liên tục đến 1 năm. Gen CAT gắn với promoter virus cũng cho kết quả biểu hiện cao. Sự định vị hóa học mô sử dụng CMV  ß-gal cho thấy rằng chỉ các sợi cơ ở vị trí tiêm biểu hiện enzyme  ß-gal. Sự biểu hiện mạnh mẽ và liên tục của gen tiêm vào cho phép đưa ra giả thuyết có thể cá mú vằn là một hệ thống đơn giản và dễ bị ảnh hưởng đối với những nghiên cứu trực tiếp chuyển gen vào cơ. Zohrah Haji Sulaiman (1999) đã thành công trong việc chuyển gen trực tiếp vào cơ vân của cá mú (Seabass, Lates calcarifer) và tôm sú (Black Tiger Prawn, Penaeus monodon). Sự biểu hiện  của gen sau khi tiêm plasmid pCMV ß-gal được theo dõi đến 14 ngày sự biểu hiện của gen ß-gal được phát hiện đầu tiên ở cá sau khi tiêm 1 ngày và ở tôm là 2 ngày. Sự biểu hiện liên tục đến 7 ngày sau khi tiêm ở cá và 14 ngày sau khi tiêm ở tôm. Tỉ lệ mẫu dương tính đối với sự biểu hiện của gen ß-gal ở cá là 33,3% và ở tôm là 20%.

Cho đến nay, ở cá người ta đã và đang tập trung nghiên cứu theo những hướng cơ bản sau:

 Chuyển gen hormone sinh trưởng (GH = growth hormone) vào cá

Hormone sinh trưởng là một protein có trọng lượng phân tử thay đổi tùy theo loài, ở người là 21.500 Da. GH được tiết ra từ thùy trước tuyến yên của động vật có xương sống. Ở động vật có vú GH cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển. GH có 191 axit amin, cấu trúc phân tử có 2 cầu nối disunfua

Sự bài tiết GH do hormone của hypothalamus là hormone giải phóng hormone sinh trưởng (GRH = growth hormone releasing hormone), hormone ức chế hormone sinh trưởng (GIH = growth hormone inhibiting hormone) theo cơ chế điều hòa ngược.

Cá đã được xử lý thí nghiệm với hormone sinh trưởng hoặc tuyến yên chiết từ các nguồn khác nhau như bò, lợn, cá. Tất cả các thí nghiệm đều làm tăng tốc độ sinh trưởng của cá. Sự sinh tổng hợp hormone sinh trưởng tái tổ hợp của gà, bò và cá hồi cầu vồng cũng đã cho thấy chức năng sinh học của gen hormone sinh trưởng bằng sự tăng cường tốc độ sinh trưởng của cá. Thật là có lý khi mong đợi cá chuyển gen hormone sinh trưởng người sẽ có chức năng giống như hormone sinh trưởng của các loài khác.

Qui trình công nghệ tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng người có thể tóm tắt bằng sơ đồ hình dưới. 

Sự tăng cường tốc độ sinh trưởng đã được quan sát ở cá chép chuyển gen MThGH.

Cơ chế của sự tăng cường sinh trưởng trong cá chuyển gen đã được khám phá dựa vào chức năng của hormone sinh trưởng người trên cơ sở sự tăng trưởng bộ xương và sự kích thích tổng hợp protein. Một số cá chép chuyển gen này vì vậy đã tăng cường độ dày cơ lưng và tăng trưởng bề ngang cơ thể và chúng đã có hình thái khác thường một cách đột ngột. Bề ngang cơ thể cho tới chiều dài cơ thể là một trong những tính trạng phân loại phổ biến. Con số này ở cá chép là 35% - 47%, nhưng ở một vài cá chép chuyển gen lại tăng lên đến 51% - 53,3%.

Mặc dù Trung Quốc không phải là nước đi đầu của cuộc cách mạng Sinh học phân tử nhưng vào năm 1985, giáo sư Zuoyan Zhu đã làm ngạc nhiên các nhà nghiên cứu Mỹ và Châu Âu khi công bố rằng nhóm nghiên cứu của ông đã chuyển được gen hormone sinh trưởng người vào cá. Theo Zhu thì thế hệ F1 của cá đã được chuyển gen này lớn gấp hai lần so với cá đối chứng. Mặc dù Zhu và cộng sự không trình bày bằng chứng đối với việc hợp nhất và biểu hiện của gen GH ngoại lai đó nhưng người ta đã thấy rằng gen GH cá có thể chuyển vào trứng của một số loài cá và được hợp nhất với DNA genome của các loài cá này.

Cá trê Châu Phi (Channel catfish) chuyển gen hormone sinh trưởng

Cá chép (Common carp) chuyển gen hormone sinh trưởng

Cá hồi chuyển gen hormone sinh trưởng (phải) và cá hồi đối chứng (trái)

Cá hồi chuyển gen hormone sinh trưởng (phải) và cá hồi đối chứng (trái)

Những nghiên cứu tiếp theo đã sử dụng một số gen GH động vật có vú, gen GH cá và các cDNA của GH. Chẳng hạn Zhang và cộng sự (1988, 1990) đã sử dụng plasmid tái tổ hợp chứa đoạn lặp lại đầu tận cùng (LTR = Long Terminal Repeat) của virus Rous sarcoma (RSV) ở chim và cDNA của GH cá hồi để vi tiêm vào phôi cá chép đang phát triển. Tách chiết DNA genome từ vây ngực cá vi tiêm và đem phân tích dot blot và Southern blot, sử dụng LTR của RSV và cDNA của GH cá hồi làm mẫu dò, người ta đã tìm thấy đoạn hợp nhất p RSV - LTR - GH - cDNA của cá hồi ổn định và đã biểu hiện ra polypetid GH cá hồi. Cá chuyển gen có kích thước trung bình lớn hơn 22% so với cá đối chứng. Mặt khác, một số cá thể được chọn một cách ngẫu nhiên từ thế hệ con lai của các cá đực chuyển gen với một cá cái không chuyển gen đã di truyền gen ngoại lai này. Chúng không những lớn nhanh hơn cá không chuyển gen trong cùng một lứa mà còn lớn nhanh hơn rất nhiều lần so với bố mẹ. Gần đây, Du và cộng sự (1992) đã công bố kết quả chuyển gen GH cá vào cá hồi Ðại tây dương. Du đã sử dụng promoter của gen protein chống lạnh của cá lon chạch lớn (ocean pout, Macrozoarces americanus) nối cới cDNA của GH cá hồi trắng (chinook salmon, Oncorhynchus tschawytscha) và kết quả là kích thước cá hồi Ðại tây dương chuyển gen một năm tuổi tăng lên từ 2 - 6 lần so với cá đối chứng.

Ở Phần Lan, tại Trường Ðại học Kuopio, các nhà khoa học đang nghiên cứu sản xuất cá hồi cầu vồng chuyển gen có tốc độ sinh trưởng cao, có khả năng chuyển hóa tốt các thành phần thức ăn, đặc biệt là các carbohydrate rẻ tiền. Molsa, Krasnov và Pitkanen (1992) đã sử dụng gen hormone sinh trưởng cá hồi Ðại tây dương (ASGHG = Atlantic Salmon Growth Hormone Gene) để chuyển vào cá hồi cầu vồng và bằng kỹ thuật PCR đã chứng minh được sự hợp nhất của gen này vào genome cá hồi cầu vồng. Tuy nhiên, gen ASGHG đã được chuyển vào các loài khác một cách rộng rãi trên thế giới nhưng không thật sự làm tăng đột ngột tốc độ sinh trưởng của các loài nhận. Các nhà nghiên cứu Kuopio tin tưởng rằng các gen này ảnh hưởng đến hiện tượng chuyển hóa, chúng có thể cải tiến hiện tượng chuyển hóa carbohydrate nên có thể sử dụng carbohydrate rẻ tiền hơn để làm thức ăn cho cá hoặc có thể tăng cường khả năng kháng bệnh. Các gen này sẽ có ý nghĩa nhiều hơn đối với các gen tăng cường sinh trưởng trong kỹ nghệ nuôi trồng thủy sản. Hiện tại, các nhà nghiên cứu thấy rằng kỹ nghệ nuôi trồng thủy sản của Phần Lan sẽ phải đợi 5 - 10 năm trước khi có thể đánh giá được cá chuyển gen thương mại. Ðể chứng minh sự hợp nhất của gen chuyển vào nhiễm sắc thể của động vật nhận và sự hoạt động của gen này các nhà nghiên cứu Kuopio sử dụng cá zebra danios. Cá zebra danios nhỏ, là loại cá nuôi nhiệt đới, thành thục trong 3 - 4 tháng và có thể nhân giống nhanh trong bể nuôi. Trứng cá được chọn và vi tiêm gen dễ dàng. Có thể thu được cá con vi tiêm và kiểm tra hoạt động gen một cách nhanh chóng. Với kết quả thu được, người ta đã thừa nhận lợi ích của gen chuyển với một thời gian rất ngắn khi so sánh với thời gian cần thiết để thừa nhận nó trong sự phát triển chậm chạp của cá hồi sống trong môi trường nước lạnh

Pitkanen và cộng sự (1999) đã chuyển gen hormone sinh trưởng cá hồi vào cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvilinus alpinus L.). Các tổ hợp gen hormone sinh trưởng được sử dụng là OnGH1, CMVGH1, OnH3GH1 và SsGH2. Cá mang gen OnGH1, CMVGH1, OnH3GH1 có tốc độ sinh trưởng tăng lên đột ngột và không có sự thay đổi gì về tốc độ sinh trưởng ở cá mang gen SsGH2. Sự có mặt của gen chuyển ở một số mô cá hồi đã được xác định.

Chuyển gen chống lạnh vào cá

Trong tự nhiên, cá sống trong nước lạnh ở hai cực quả đất, ở biển nhiệt đới ấm áp và ở những vùng nước ôn hòa. Ở những nơi này các điều kiện nhiệt độ thay đổi theo ngày cũng như thay đổi theo mùa. Trải qua tiến trình tiến hóa lâu dài, cá đã có các cơ chế sinh lý thích nghi với những điều kiện nhiệt độ thay đổi này. Cũng như nhiều sinh vật khác, cá sử dụng các gen sốc nhiệt để phản ứng với nhiệt độ tăng cao, nhưng trong điều kiện lạnh quá, một vài loài cá đã tiến hóa theo hướng gen chống lạnh mã hóa protein giữ cho máu của chúng khỏi đông. De Vries đã phát hiện ra protein chống lạnh (AFPs = antifreeze proteins). Theo De Vries (1969, 1971), cá ở vùng Bắc cực và Nam cực thì gen AFP biểu hiện suốt cả năm, trong khi các loài cá sống ở vùng nước ôn hòa (như cá bơn mùa đông) AFPs chỉ biểu hiện trong mùa đông. Các protein này cho phép cá sống được ở điều kiện nhiệt độ lạnh.

De Vries và cộng sự (1971), Lin và cộng sự (1972) đã phát hiện protein chống lạnh của cá Nam cực bao gồm những đơn vị lặp lại Ala-Ala-Thr với một disaccharide, galactosyl-n-acetylgalactose amine, nhóm gốc đường này liên kết với threonine. AFPs cá bơn mùa đông là một protein xoắn giàu alanin, không có disaccharide. Các cấu trúc bậc 1, bậc 2, bậc 3 của chúng đã được xác định. Cơ chế tối ưu của các protein này là chúng liên kết với những vi tinh thể nước đá và do đó làm hạ thấp điểm đông của máu. Các gen protein chống lạnh của một số loài cá đã được làm sáng tỏ.

Hew và cộng sự (1988) đã vi tiêm gen AFP cá bơn mùa đông vào cá hồi không có AFP. Mặc dù họ đã chứng minh được sự hợp nhất của gen AFP vào genome của cá hồi nhưng không có bằng chứng đối với sự biểu hiện của gen AFP. Tuy nhiên, sau đó họ đã có các chứng cớ sơ bộ về sự biểu hiện của gen AFP cá bơn mùa đông (Pseudopleuronectes americanus) ở cá hồi chuyển gen mặc dù mức độ biểu hiện của gen AFP còn quá thấp để bảo vệ cơ thể chống lại sự lạnh giá. Những kết quả nghiên cứu bước đầu này rất khả quan và cho ta giả thiết một cách chắc chắn rằng, khi các mức AFP thích hợp được biểu hiện chúng sẽ mở rộng khả năng sống của cá hồi vào mùa đông trong các bể nuôi cá nước mặn. Ðây là một thuận lợi lớn cho việc nuôi trồng nguồn thủy sản quan trọng này. Với mục đích đó, việc nghiên cứu đang được tiến hành thăm dò đối với các promoter riêng.

Wang và cộng sự (1995) đã tiêm gen AFP cá lon chạch lớn (Macrozoarces americanus) vào trứng cá vàng (Carassius auratus) thành công và đã chứng minh được sự biểu hiện của gen AFP ở cá vàng. Cá vàng chuyển gen có khả năng chịu lạnh tốt hơn cá đối chứng khi đưa chúng vào môi trường có nhiệt độ thấp.

Chuyển gen kháng bệnh vào cá

Một hướng ứng dụng khác của cá chuyển gen là khả năng kháng bệnh. Cho đến nay, hai phương pháp khác nhau đã được thử nghiệm. Một phương pháp với mục đích là tăng sức đề kháng đối với các bệnh do vi khuẩn và một phương pháp nhằm vào các mầm bệnh virus đặc trưng.

Một ứng dụng của phương pháp đầu tiên liên quan đến việc tăng cường enzyme kháng khuẩn lysozyme ở cá bằng cách đưa trình tự mã hóa lysozyme cá hồi cầu vồng gắn với promoter AFP của các lon chạch Mỹ (Macrozoarces americanus) vào cá hồi Ðại tây dương (Hew, 1995). Ðây là một cấu trúc mà tất cả đều bắt nguồn từ cá với trình tự mã hóa protein có nguồn gốc từ một loài khá thân thuộc. Một hiệu quả tương tự có thể được tạo ra bằng cách lai khác loài và chọn lọc (cá hồi Ðại tây dương lai với cá hồi nâu (Salmo trutta), cá hồi nâu có thể được lai với cá hồi cầu vồng) và các kỹ thuật chuyển gen sẽ làm tăng tốc độ của quá trình này một cách đơn giản và tạo ra một giống cá có kiểu gen xác định tốt hơn rất nhiều.

Cấu trúc gen chuyển lysozyme đã được đưa vào cá hồi Ðại tây dương nhưng cho đến nay chưa có kết quả nào về năng suất của cá và hiệu quả của gen chuyển được công bố.

Một ứng dụng thứ hai của việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen để tăng khả năng kháng bệnh là bảo vệ cá hồi cầu vồng chống lại sự nhiễm virus hematopoietic necrosis (IHNV). IHNV là một nguồn bệnh của cá hồi gây ra tỷ lệ chết cao, đặc biệt là đối với cá bột và cá hồi nhỏ. Các loại vaccine chết-bất hoạt (killed vaccine), vaccin giảm độc lực (attenuated vaccine) và vaccine tiểu đơn vị (subunit vaccine) đều đã được phát triển nhưng cả ba loại đều có những hạn chế nhất định. Sự tiêm chủng vaccine DNA sử dụng các trình tự mã hóa protein G và N của IHNV đã được Anderson thực hiện ở cá hồi cầu vồng vào năm 1996. Các plasmid tái tổ hợp được tiêm trực tiếp vào cơ của cá bột. Một mình trình tự protein N không đủ gây ra miễn dịch nhưng trình tự mã hóa protein G hoặc một mình hoặc kết hợp với trình tự N gây ra miễn dịch do hiệu quả làm virus chết.

Những hướng nghiên cứu cá chuyển gen khác

Ngoài việc chuyển gen GH, gen chống lạnh và gen kháng bệnh đã nói ở trên, một số các gen khác cũng đã được chuyển vào cá chép, cá trê, cá hồi, cá vàng, cá medaka, cá chó Bắc cực (Northern pike) và một số loài cá khác. Các gen này có nguồn gốc từ tập hợp các nguồn sinh vật khắp nơi (gen kháng hygromycin, gen neomycin phosphotransferase (neo), gen chloramphenicol transacetylase, gen crystalline gà, gen a-globin, gen luciferase, gen ß-galactosidase, gen chống lạnh...). Khi chuyển vào cá, các gen vi tiêm được gắn với nhiều promoter khác nhau (mouse methallothionein (mMT), Rous sarcoma virus (RSV), fish antifreeze protein promoter (AFP)...).

Vào năm 1986, Ozato và cộng sự đã chứng minh rằng cá medaka (Oryzas latipes) được vi tiêm tổ hợp mMT chuột với gen crystalline (Cry) gà thì gen ngoại lai này đã hợp nhất với DNA genome của cá medaka và đã biểu hiện gen mới này. Oshiro và cộng sự (1989) đã công bố gen α-globin cá chép đã gắn được vào DNA genome cá hồi cầu vồng. Mc Evoy và cộng sự (1988) đã chỉ ra rằng cá hồi Ðại tây dương chuyển gen có thể biểu hiện gen ß-galactosidase khi kết hợp với mMT. Yoon và cộng sự (1990) đã đưa ra bằng chứng về sự chuyển gen, sự hợp nhất và sự phiên mã của gen neo trong cá vàng nhưng bằng chứng về sự biểu hiện gen không được làm sáng tỏ. Stuart và cộng sự (1988) sử dụng cá mú vằn (zebrafish) làm mô hình chuyển gen kháng hygromycin, đã chứng minh được sự hợp nhất vào hệ gen và sự di truyền lại cho thế hệ sau của gen này. Chen và Power (1990) đã chứng minh được sự hợp nhất, sự biểu hiện và sự di truyền lại cho thế hệ sau của tổ hợp gen chloramphenicol transacetylase.

Lu và cộng sự (1997) đã sử dụng vector retrovirus đa hướng (pantropic retrovirus vector) để chuyển gen vào cá medaka Nhật bản (Orizias latipes). Các vector này chứa LTR của virus bạch cầu chuột Moloney (Moloney murine leukemia virus = Mo-MLV) và một gen chuyển (neo hoặc lacZ) được điều hòa bởi đoạn LTR của RSV. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh được sự xâm nhập, sự biểu hiện và sự di truyền lại cho thế hệ con lai F1 của tổ hợp gen này.

Trong một số nghiên cứu cá chuyển gen, hiệu quả đạt được thấp, trung bình chỉ từ 5-10%. Một số nhà nghiên cứu khác cho rằng khi nghiên cứu chuyển gen người vào cá chép, sự hợp nhất gen ngoại lai với genome vật chủ đạt được từ 40 - 88%.

Ngoài việc góp phần tăng năng suất lên nhiều lần cho ngành nuôi trồng thủy sản, cá chuyển gen còn cung cấp các mô hình thí nghiệm tuyệt vời cho các nghiên cứu khoa học cơ bản cũng như các nghiên cứu ứng dụng Công nghệ Sinh học.

Ở Việt Nam, tại Phòng Công nghệ gen Ðộng vật, Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Việt Nam, Nguyễn Văn Cường và cộng sự đã và đang nghiên cứu chuyển tổ hợp gen hormone sinh trưởng người (MThGH) vào chuột, cá vàng (Carassius autarus), cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) và cá chép (Cyprinus carpio). Với một số kết quả bước đầu đã đạt được, việc nghiên cứu tạo cá chuyển gen đang được tiếp tục tiến hành.

Nguồn tham khảo

Trần Quốc Dung -VOER