Mutiplex PCR - PCR đa mồi

Series bài viết

• PCR cơ bản 
• Realtime PCR
• Multiplex PCR
• Western Blot

1. Giới thiệu chung về multiplex PCR

Multiplex PCR là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằm khuếch đại nhiều trình tự ADN chỉ trong một phản ứng PCR. Trong quá trình phân tích PCR đa mồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng. Như một phương pháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phương pháp này giúp rút ngắn thời gian thực hiện mà lại không ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm.

Các loại phản ứng multiplex PCR

Phản ứng multiplex PCR có thể chia thành 2 loại:

a) Phản ứng multiplex PCR dùng một khuôn

Phương pháp này sử dụng một loại khuôn, thường là ADN hệ gen, cùng với các cặp mồi (các mồi xuôi và mồi ngược) để khuếch đại một vùng gen cụ thể có chứa trong sợi khuôn.

b) Phản ứng multiplex PCR dùng nhiều khuôn

Có thể thực hiện duy nhất một phản ứng với nhiều loại khuôn và nhiều cặp mồi. Tuy nhiên sự có mặt của nhiều cặp mồi có thể dẫn đến việc liên kết chéo giữa các mồi với nhau và có thể có sự bắt cặp nhầm giữa mồi này và khuôn kia. Do đó việc thiết kế mồi là rất quan trọng.

Nguồn: http://www.premierbiosoft.com

2. Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR

Thiết kế mồi đặc hiệu là một trong những yếu tố quyết định đến sự thành công của phản ứng multiplex PCR. Các lưu ý quan trọng khi thiết kế mồi cho phản ứng này được liệt kê bên dưới. Đây có thể coi là chìa khóa quyết định sự chính xác của quá trình khuếch đại các trình tự ADN với hàm lượng sản phẩm cao nhất.

a) Chiều dài mồi

Phản ứng multiplex PCR chứa nhiều cặp mồi khác nhau, vì vậy nó đòi hỏi các mồi được thiết kế phải có chiều dài thích hợp. Thông thường các mồi có chiều dài khoảng từ 18 đến 22 nucleotide.

b) Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm)

Các mồi nên có nhiệt độ nóng chảy tương đương nhau, tốt nhất là nằm trong khoảng từ 55°C - 60°C. Với những trình tự có tỷ lệ GC cao, Tm của mồi có thể cao hơn (khoảng 75°C - 80°C). Độ dao động về Tm giữa các mồi nên nằm trong khoảng 3°- 5°C.

c) Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu là vấn đề cần được quan tâm hàng đầu trong quá trình thiết kế mồi. Với phản ứng multiplex PCR nó càng trở nên quan trọng, đặc biệt là trong các phản ứng có xảy ra cạnh tranh về mồi và khuôn.

d) Tránh hình thành dimer primer

Các mồi được thiết kế nên được kiểm tra xem chúng có hình thành dimer không. Dimer primer (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau) có thể dẫn đến việc khuếch đại không đặc hiệu.

Tất cả các chỉ số cần lưu ý khi thiết kế mồi gần giống với thiết kế mồi cho 1 phản ứng PCR thông thường. Thông thường, khi tỷ lệ Mồi/Khuôn quá cao cũng có thể dẫn đến việc hình thành primer dimer, do đó phải chú ý chỉ số của các thành phần trong phản ứng.

e) Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng phần mền PrimerPlex

PrimerPlex là 1 công cụ hữu ích cho quá trình thiết kế mồi đối với phản ứng multiplex PCR. Chương trình này giúp kiểm tra các oligo xem chúng có phản ứng chéo với nhau hay không, đồng thời tăng sự thích ứng giữa các mồi. Quá trình này phân tích hàng triệu cặp mồi khả dĩ chỉ trong vài giây, sau đó chương trình đưa ra danh sách các mồi để người thiết kế lựa chọn.

3. Ưu điểm của phương pháp multiplex PCR

a) Đối chứng nội kiểm (Internal control)

Vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR đơn lẻ (Single PCR) là hiện tượng âm tính giả do sai về các thành phần hay chu trình nhiệt, cũng có khi lại là hiện tượng dương tính giả do bị nhiễm. Phương pháp multiplex PCR đã khắc phục được hiện tượng âm tính giả do mỗi sản phẩm khuếch đại sẽ cung cấp một giá trị giúp kiểm tra các phân đoạn được khuếch đại khác.

b) Hiệu quả cao

Chi phí về hóa chất và thời gian tiến hành multiplex PCR giảm đáng kể so với một phản ứng PCR đơn lẻ. Các phản ứng multiplex PCR cũng bảo đảm được độ bền của enzyme polymerase và khuôn.

c) Xác định được chất lượng khuôn

Phản ứng multiplex PCR có thể xác định được chất lượng mẫu (khuôn) hiệu quả hơn phản ứng PCR thông thường.

d) Xác định được hàm lượng khuôn

Lũy thừa các số lượng bản sao và các tiêu chuẩn của phản ứng multiplex PCR có thể được sử dụng để ước lượng hàm lượng khuôn có trong mẫu. Để xác định được hàm lượng khuôn chính xác bằng phản ứng multiplex PCR cần phải có mẫu đối chiếu, số chu kỳ phản ứng và lượng tối thiểu chất ức chế phải được xác định sau mỗi mỗi chu kỳ khuếch đại.

Phản ứng multiplex PCR có thể ứng dụng trên cả khuôn là ARN sau khi chuỗi này được chuyển thành dạng cADN. Sợi cADN sẽ đóng vai trò làm khuôn cho phản ứng.

4. Tối ưu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR

a) Nồng độ mồi

Nồng độ mồi ban đầu cho phản ứng có nồng độ từ 0.1 µM đến 0.5 µM. Có thể điều chỉnh chỉ số này tùy thuộc vào từng điều kiện phản ứng, ví dụ, người ta có thể tăng hàm lượng mồi đối với các locus “yếu” và giảm nồng độ mồi với các locus “mạnh”. Nồng độ cuối cùng của mỗi mồi trong phản ứng nên nằm trong khoảng từ 0.04 µM đến 0.5 µM. Với số lượng bản sao thấp hay ADN phức tạp, nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.3 µM đến 0.5 µM. Ngược lại nếu số lượng bản sao lớn hay ADN khuôn ít phức tạp thì nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.04 µM đến 0.4 µM.

b) Nồng độ dNTP và MgCl­­2

Nồng độ MgCl­­2 nên giữ cố định ở mức 2 mM. Nồng độ dNTP có thể dao động từ 0.5 mM đến 1.6 mM. Nồng độ thích hợp nhất của từng loại dNTP là từ 0.2 mM đến 0.4 mM. Quá ngưỡng này sẽ làm giảm tốc độ phản ứng. Nồng độ mỗi loại dNTP thấp hơn 0.1 mM sẽ vẫn giữ được tốc độ phản ứng nhưng lại làm giảm số lượng sản phẩm. dNTP gốc (stock) nhạy cảm với quá trình rã đông, do đó làm hiệu quả phản ứng multiplex PCR có thể giảm. Để khắc phục nhược điểm này, dNTP nên được chia thành từng lượng nhỏ trước khi bảo quản ở -20ºC.

Do MgCl­­2 ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả hoạt động của enzyme Taq ADN polymerase nên nồng độ Mg2+ phải được kiểm tra chặt chẽ. Enzyme Taq polymerase, khuôn, dNTP và các mồi đều liên kết với MgCl­­2 nên nồng độ MgCl­­2 phụ thuộc vào nồng độ các thành phần này. Hơn nữa, nếu khuôn hoặc mồi có chứa EDTA hay EGTA thì nồng độ MgCl­­2­ cũng sẽ được điều chỉnh. Mg2+ giúp ổn định cấu trúc sợi đôi, bảo vệ ADN khỏi bị biến tính. Nồng độ Mg2+ cao có thể dẫn đến việc làm tăng lượng sản phẩm không đặc hiệu do nó tác động đến quá trình gắn mồi lên sợi khuôn. Tuy nhiên nếu hàm lượng Mg2+ không đủ cũng sẽ làm giảm lượng sản phẩm cần thiết.

c) Sự cân bằng dNTP/ MgCl­­2­

Để làm việc hiệu quả, Taq ADN polymerase cần Mg tự do (bên cạnh Mg liên kết với dNTP và ADN).  Đây là lí do tại sao khi tăng nồng độ dNTP thì tốc độ phản ứng PCR lại giảm trong khi đó tăng nồng độ Mg lại cho kết quả ngược lại. 0.2 mM dNTP kết hợp với 1.5 đến 2 mM MgCl2  là hợp lí.

d) Nồng độ dung dịch đệm (buffer)

Dùng đệm nồng độ 2X sẽ cải thiện hiệu quả của phản ứng multiplex PCR. Nó hiệu quả hơn bất kỳ chất điều chỉnh nào (như DMSO, glycerol, BSA). Các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN có chiều dài lớn sẽ hoạt động tốt hơn ở nồng độ muối thấp trong khi các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN ngắn hơn yêu cầu nồng độ muối cao hơn.

e) Lượng ADN khuôn và Taq ADN polymerase

Khi lượng khuôn ADN thấp, hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu của phản ứng có thể tăng lên nếu hạ thấp nhiệt độ gắn mồi. Người ta tiến hành thử nghiệm ở các nồng độ Taq ADN polymerase khác nhau, sau đó đưa ra được nồng độ tối ưu đối với enzyme này 2.5U/ 50µl dịch phản ứng. Nếu quá nhiều enzyme, nồng độ glycerol dùng để bảo quản enzyme có thể làm mất cân bằng quá trính khuếch đại làm tăng sự nhiễu. Tỷ lệ mồi đặc hiệu và hỗn hợp phụ thuộc vào hoạt tính của enzyme, các thành phần thiết yếu trong phản ứng như MgCl2, dNTPs và bản chất của ADN đích. Vì vậy, một loạt các cải tiến được thực hiện nhằm cải thiện quá trình PCR chủ yếu định hướng trực tiếp vào các yếu tố tác động đến việc gắn mồi và kéo dài chuỗi.

f) Sử dụng các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol, BSA

Hầu hết các phản ứng multiplex PCR khó thực hiện đều phải được hỗ trợ bởi các chất phụ gia như DMSO, glycerol, formamide và betaine. Những phụ gia này giúp làm lỏng chuỗi ADN, do đó ADN dễ dàng bị biến tính bằng nhiệt nhanh hơn. Tuy nhiên, trong các phản ứng multiplex PCR, DMSO và glycerol lại gây ra sự cạnh tranh. Vì vậy, nồng độ của các chất này cũng nên được xem xét kiểm tra chặt chẽ. Nồng độ BSA đạt tới 0.8 µg/µl sẽ làm tăng hiệu quả phản ứng hơn nhiều so với việc bổ sung DMSO và glycerol.

5. Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR

Multiplex PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi, có thế xác định sự có mặt cùng lúc nhiều tác nhân khác nhau như virus, vi khuẩn và các tác nhân xâm nhiễm khác. Đồng thời, phản ứng multiplex PCR cũng được dùng để xác định các thành phần có trong một hỗn hợp mẫu hoặc cũng có thể dùng để xác định sự có mặt của nhiều gen đơn lẻ trong hệ gen.

Nguồn http://www.chimicare.org

Phản ứng multiplex PCR được sử dụng vào các mục đích:

1. Xác định tác nhân gây bệnh

2. Hiệu suất SNP genotyping cao

3. Phát hiện đột biến

4. Phát hiện đột biến mất trong gen

5. Định lượng mẫu

6. Phân tích các liên kết

7. Phát hiện ARN

8. Nghiên cứu pháp y

Tài liệu tham khảo

1. P. Markoulatos, N. Siafakas and M. Moncany (2002), "Multiplex Polymerase Chain Reaction: A Practical Approach", Journal of Clinical Laboratory Analysis, (16), pp.47-51.

2. http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/multiplex-pcr.html

Nguồn: biomedia.vn