Phương thức sử dụng CRISPR Cas9 tạo đột biến indel knockout gen mục tiêu

Series bài viết: 

• Cơ chế hoạt động của CRISPR/CAS9
• Ứng dụng linh hoạt CRIPSR/Cas9 trong chỉnh sửa bộ gen 
• Phương thức sử dụng CRISPR/Cas9 tạo đột biến indel knockout gen mục tiêu

Các gRNA được thiết kế đặc hiệu để xác định vị trí chèn hoặc loại bỏ (indels) sẽ xảy ra. Khi gRNA và Cas9 được biểu hiện trong các tế bào mục tiêu, các gRNA sẽ điều khiển Cas9 liên kết với trình tự mục tiêu và cắt sợi đôi DNA tại vị trí nhận biết-đặc tính chuyên biệt của các endonuclease. Từ đó, các tế bào có thể sửa chữa tại vị trí cắt với những đoạn trung gian không tương đồng như NHEJ (non-homologous end joining) hoặc tương đồng HDR (homologous directed repair).

NHEJ được sử dụng như là một cơ chế sửa chữa tích cực nhất nhưng thường dẫn đến indels gần trình tự mục tiêu. Nếu indel xảy ra trong khung đọc ORF (open reading frame), nó có thể làm thay đổi khung ORF dẫn đến tín hiệu của mã kết thúc sớm (premature stop codon) qua đó loại bỏ các chức năng ban đầu của gen-tắt gen gây bệnh. Các phân tích gen như SURVEYOR hoặc giải trình tự gen (Sanger hoặc NGS)[8] sau đó sẽ giúp xác định các tế bào có chứa indels ở gen mục tiêu hay không. Ngoài ra, bằng cách sử dụng cơ chế sửa chữa không hoàn hảo của tế bào, CRISPR cho phép các nhà khoa học chỉ đơn giản là xây dựng thư viện các dòng tế bào với knockout indel tại những vùng của bộ gen muốn nghiên cứu.

NHỮNG BƯỚC CẦN THIẾT KHI BẮT ĐẦU THAO TÁC THÍ NGHIỆM VỚI CRISPR/CAS9 TRÊN TẾ BÀO:

Bước 1: Xác định loại tế bào sử dụng và trình tự gen mục tiêu

Bước 2: Thiết kế các trình tự oligo và primer cần thiết: gRNA, Fw, Rv

Sử dụng công cụ CRISPR Design Tool: http://tools.genome-engineering.org

Hoặc Benchling: https://benchling.com/academic

Lựa chọn trình tự mục tiêu (ví dụ, một đoạn gen 1-kb từ các khu vực quan tâm), xác định và phân loại các vùng mục tiêu phù hợp. Các thông số được thiết lập giúp tính toán cho từng mục tiêu dự định. Ngoài ra, công cụ còn có thể chọn trình tự gRNA bằng cách xác định trình tự 20 bp bất kỳ với đầu 5¢-NGG.

Bước 3: Tổng hợp gRNA [7]

a

Có thể tổng hợp gRNA bằng phương pháp PCR hoặc phương pháp cloning

Việc lựa chon phương pháp nào sẽ phụ thuộc vào dòng tế bào lựa chọn để thao tác và mức độ hiệu quả vận chuyển đến gen mục tiêu

Clone gRNA vào plasmid

Quy trình tham khảo từ phòng lab của giáo sư  Feng Zhang tại Viện MIT: clone gRNA vào plasmid PX330

Protocol:

Bước 1: Order oligo cho việc tổng hợp gRNA
Bước 2: Phosphorylate and anneal oligo
Bước 3: Cắt vector với enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) BbsI và nối với oligo gRNA
Bước 4: Biến nạp plasmid vừa nối ở bước 3 vào tế bào
Bước 5: Chọn những khuẩn lạc và phân tích xác định trình tự bằng phương pháp giải trình tự

Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp:

Ưu điểm:

Sau khi được clone vào plasmid, gRNA sẽ dễ dàng xâm nhiễm vào tế bào như HEK (human embryonic kidney) với cấu trúc vòng siêu xoắn (supercoiled) của plasmid
Plasmid dễ dàng sao chép và có thể dự trữ lâu dài cho các quy trình nghiên cứu lớn.
Nhược điểm:

Dạng plasmid sẽ dẫn đến việc xâm nhiễm vào tế bào của gRNA gặp khó khăn đối với một vài dạng tế bào như tế bào gốc phôi (human embryonic stem cell)

Tổng hợp gRNA bằng phương pháp PCR

Phương pháp này cần bổ sung trình tự T7 promoter vào trình tự gRNA trong quá trình thiết kế oligo gRNA. Phản ứng PCR được thực hiện như một phản ứng tổng hợp mRNA và sử dụng enzyme T7 polymerase cho quá trình tổng hợp

Protocol tham khảo từ phòng lab của giáo sư Jennifer Doudna

Bước 1: Order oligo cho việc tổng hợp gRNA
Bước 2: Tổng hợp gRNA như một mRNA bằng phương pháp PCR
Bước 3: Tinh sạch và xác định hàm lượng mRNA

Ưu điểm:

Là lựa chọn ưu việt cho việc xâm nhiễm gRNA vào các tế bào khó xâm nhiễm như tế bào gốc phôi
RNA chỉ tồn tại trong thời gian ngắn. Vì vậy, hện thống gRNA và Cas9 xâm nhiễm tế bào dạng mRNA sẽ bị phân hủy nhanh chóng sau đó nên sẽ không di truyền cho các thế hệ tế bào tiếp theo.

Nhược điểm:

Không có phương pháp cho việc sàng lọc các tế bào có chứa hệ thống gRNA và Cas9
Cần kinh nghiệm thao tác trên RNA để đảm bảo việc tổng hợp mRNA đạt hiệu quả cao.

Bước 4: Vận chuyển phức hợp gRNA-Cas9 đến tế bào mục tiêu[9]

Việc vận chuyển phức hợp gRNA/Cas9 đến tế bào mục tiêu có thể theo 3 phương pháp khác nhau: Lipofection, Electroporation, Lentiviral transduction

Việc lựa chọn phương pháp nào sẽ phụ thuộc vào dòng tế bào lựa cũng như những ưu và nhược điểm của mỗi phương pháp.

Lipofection

Lipofection là phương pháp dựa trên đặc tính của liposome mang điện tích dương sẽ liên kết với DNA/RNA mang điện tích âm tạo nên một phức hợp mang mạng lưới điện tích dương từ đó giúp việc tiếp cận (bám) và xâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng hơn

Quy trình thực hiện khá đơn giản: Chuẩn bị hỗn hợp chứa gRNA/Cas9 và tiểu bào lipid (lipid visicles) để tạo thành phức hợp liposome-gRNA/Cas9. Sau đó, cho trực tiếp phức hợp này vào môi trường chứa tế bào. Nuôi ủ 24h và tế bào bắt đầu biểu hiện gRNA/Cas9

Ưu điểm:

Quy trình đơn giản, dễ thao tác và không yêu cầu bất kỳ thiết bị phức tạp nào

Linh động vì có thể vận chuyển cả DNA hoặc RNA vào tế bào

Nhược điểm:

Không là phương pháp được lựa chọn cho việc vận chuyển cho nhiều loại tế bào, chẳng hạn tế bào gốc phôi

Electroporation

Electroporation là phương pháp sử dụng dòng điện 300-400mV để tạo ra xung động đến tế bào trong khoảng thời gian ít hơn 1/1000 giây. Xung động này giúp tạo ra những lỗ tạm thời trân màng tế bào và thông qua đó gRNA/Cas9 xuyên qua để đi vào tế bào đến locus mục tiêu.

Ưu điểm:

Nhanh, tốn ít thời gian. Vì vậy, có thể vận chuyển gRNA/Cas9 vào một số lượng lớn tế bào trong thơi gian ngắn

Nhược điểm:

Cần thiết bị chuyên biệt cho phương pháp này

Cần khảo sát thời gian và cường độ dòng điện phù hợp để tránh sự chết của tế bào trong suốt quá trình thực hiện.

Lentiviral transduction

Lentiviral transduction là phương pháp sử dụng lentiviral vector để vận chuyển gRNA/Cas9 vào tế bào thông qua cơ chế xâm nhiễm của virus. Lentiviral vector có nguồn gốc từ một lớp của Retrovirus-gây ra suy giảm hệ thống miễn dịch ở người (HIV-1)

Quy trình thực hiện:

Plasmid chứa gRNA/Cas9 trước hết cần được đưa vào tế bào 293T để tạo ra các hạt lentivirus chức năng mang gRNA/Cas9. Các hạt này được thu nhận và cho tải nạp (transduction) vào tế bào mục tiêu. Sau khi vào tế bào, RNA của virus bao gồm cả gRNA/Cas9 sẽ phiên mã ngược, đi vào nhân và tiến đến các loci một cách ngẫu nhiên.

Ưu điểm:

Hiệu quả xâm nhiễm/tải nạp cao kể cả những dòng tế bào khó như tế bào thần kinh

Nhược điểm:

Quy trình thực hiện phức tạp, mất nhiều thời gian. Mất ít nhất 2 tuần để tải nạp các hạt lentiviral vào tế bào mục tiêu.

Không thể kiểm soát vị trí tương tác giữa bộ gen virus và gen tế bào mục tiêu. Một vài trường hợp có thể ảnh hưởng đến chức năng tế bào. Vấn đề này có thể được xem xét và thử với adeno-associated virus (AAV) và sẽ cần thêm thời gian cho việc này.

Bước 5: Phát hiện các indel

Có 2 cách để phát hiện các indel bao gồm SURVEYOR và giải trình tự [8]

Bước 6: Xác định hiệu quả knockout gen hay hiệu quả chỉnh sử gen mục tiêu của hệ thống CRISPR/Case

Phân tích bằng RFLP

Phân tích bằng phương pháp giải trình tự: Sanger, NGS [8]

Tham khảo:

 [5] https://blog.benchling.com/how-to-create-knockouts-using-crispr/

[6] https://www.addgene.org/crispr/guide/

 [7] https://blog.benchling.com/how-to-synthesize-your-grnas-for-crispr/

[8] Ran, F.A., et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system, doi:10.1038/nprot.2013.143

[9] https://blog.benchling.com/how-to-express-crispr-in-your-target-cells/

Nguồn: ibsgacademic.com