Ứng dụng và nguyên lý của kỹ thuật Western blot

Series bài viết

• PCR cơ bản 
• Realtime PCR
• Multiplex PCR
• Western Blot
• Southern Blot
• Southern Blot

Kỹ thuật Western blot

Western blot là phương pháp phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE, thường chỉ sử dụng kháng thể có gắn phóng xạ hoặc gắn huỳnh quang để phát hiện một loại protein nào đó, được dùng rộng rãi trong chẩn đoán HIV, viêm gan.

Nguyên lý kỹ thuật western blot

Là kỹ thuật lai giữa protein với protein (giữa kháng nguyên với kháng thể) protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.

Trong Western Blot, một hỗn hợp protein được phân tách bằng điện di SDS-PAGE, miếng gel được ngâm với sodium dodecyl sulfate (SDS) – là một tác nhân biến tính protein. Các vạch protein được chuyển lên màng nitrocellulose và từng vạch protein được phát hiện bằng cách ngâm màng cellulose với kháng thể đơn dòng và đa dòng có gắn enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm. Nếu protein quan tâm được kết hợp bởi kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trí của nó trên các điểm có thể được phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm film X quang.

Quy trình

Bước 1: Xử lý mẫu

Lấy mẫu từ mô thực vật hoặc động vật hay môi trường nuôi cấy. Đầu tiên xử lý rắn bằng phương pháp cơ học sử dụng máy nghiền. Thêm vào các chất tẩy rửa, muối và dụng dịch đệm để ly giải tế bào và hoà tan protein.

Bước 2: Điện di trên gel

Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trên điểm đẳng nhiệt, khối lượng phân tử, điện tích hoặc phối hợp các yếu tố trên.

Phương pháp điện di phổ biến nhất là điện di trên gel polyacrylamide và có bổ sung sodium dodecyl sulfate (SDS).

Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai

Người ta sử dụng phương pháp thẩm tách điện để chuyển protein từ gel lên màng lai, sử dụng một dòng điện để kéo dài các protein từ gel lên màng PVDF hoặc nitrocellulose.

Bước 4: Xử lý màng lai

Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên thường thực hiện các bước để ngăn chặn liễn kết giữa màng và kháng thể được sử dụng để xác định protein mục tiêu.

Bước 5: Quá trình lai và phát hiện vị trí lai

Để phát hiện các protein chuyên biệt, màng được dò protein quan tâm bằng kháng thể đã biến đổi có khả năng liên kết với enzyme thông báo, enzyme này kết hợp với một cơ chất tương ứng sẽ thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang và tạo màu. Quá trình này diễn ra gồm 2 bước:

Màng lai đã cố định protein được lai với kháng thể sơ cấp.

Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp tục gắn kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp) có gắn enzyme. Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Đặt một tấm phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme.

Ứng dụng

Xác định sự hoạt động của gell thông qua sự có mặt của protein trong mô.

Nhận dạng protein mục tiêu.

Đánh giá tính chuyên biệt của kháng thể.

Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra: thử nghiệm khẳng định HIV, viêm gan B.

Năm 2002, đã ứng dụng thành công phương pháp Western Blot trong việc xác định kháng nguyên giun đũa chó trên thỏ, mở ra một hướng đi mới trong việc xét nghiệm chẩn đoán chính xác các bệnh ký sinh trùng trên người.

Nguồn: kythuatysinh.net